ddTRAPアッセイは、細胞内のテロメラーゼ酵素活性の高感度、堅牢、高定量的測定を得る能力を提供します。中スループット方式で 1 回あたり最大 96 サンプルを実行できることで、大きな利点があります。収集されたデータに対して適切な統計分析を行うコントロールと複製を実行できます。
細胞をライシングする直前に、NP-40リシスバッファーの凍結アリコートを解凍する。解凍したら、氷の上にリシスバッファーを置きます。PMSFプロテアーゼ阻害剤をNP-40リシスバッファーに加え、0.2ミリモルの最終濃度に到達します。
次いで、細胞ペレットを含むチューブに40マイクロリットルのライシスバッファーを加え、1マイクロリットル当たり25,000細胞の細胞同等値に達する。細胞を開くために、ライセートを上下に軽くピペットします。泡を作らないようにしてください。
細胞を氷の上で30分間氷上でライスします。細胞デブリのクラスターが形成されるのを防ぐために、10分ごとにlysateを穏やかに渦を起させます。細胞のリシスの間に、テロメラーゼ伸長反応のためのマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、氷の上に保存する。
細胞のリシスの後、延長マスターのピペット48マイクロリットルが各PCRチューブに混合する。各PCRチューブに希釈したライセートを2マイクロリットル加え、1マイクロリットル当たり50細胞の最終的な細胞同等性に達し、原稿に従ってテロメラーゼ伸展反応を継続する。ddTRAP用のマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、室温に保ちます。
ピペット19.8マイクロリットルのddPCRマスターは、各PCRチューブに混合します。各チューブに2.2マイクロリットルの伸張反応液を加える、 22マイクロリットルの総容積を残す。液滴生成カートリッジをセットアップするには、まず準備した溶液の20マイクロリットルをカートリッジの中のサンプルウェルに積み込みます。
カートリッジの側面を軽くタップして、泡を溶液の上部に移動します。カートリッジのすべてのウェルは、オイルをロードする前にサンプルを積み込む必要があります。その後、70マイクロリットルの液滴発生油を左油によく積み込む。
ガスケットをカートリッジの端にテザリングして所定の位置に固定し、装填および組み立てられたカートリッジを液滴発生器に挿入します。発電機はカートリッジが正しく置かけられていることを知らせる固体緑色のライトを示す。60~90秒後、発電機のライトが点滅を止めると、サイクルが完了します。
カートリッジを取り外します。カートリッジからガスケットをそっと取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、新たに生成された液滴を右から96ウェルPCRプレートに約40マイクロリットルのピペットで送ります。
すべてのサンプルを96ウェルプレートにロードすると、蒸発を防ぐために、アルミニウム箔PCRプレートシールでプレートを熱シールします。次に、96ウェルプレートをサーモサイクラーにロードして、PCR反応を行います。まず、96ウェルプレートを液滴リーダーにロードします。
A1サンプルがホルダーのサンプルと一致するようにプレートを正しく向けます。ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェル A01 をダブルクリックして、サンプルウェルエディター画面を開きます。
[実験]をクリックし、ドロップダウン メニューから使用するアッセイの種類を選択します。正しい検出方法として QX200 ddPCR エヴァグリーン スーパーミックスを選択します。ウェルエディタ画面の右下にある[適用]をクリックして、ハイライト表示されたすべてのウェルにユーザ定義設定を保存します。
次に、ウェルエディタ画面で[ターゲット]をクリックし、[ターゲット]ドロップダウンメニューをクリックして、不明、参照、またはテンプレートなしのいずれかのコントロールを選択してサンプルの種類を定義します。[サンプル名]セクションで、すべてのサンプルにラベルを付け、[適用]をクリックします。[実行] をクリックしてプレートを読み上げました。
プレートの読み取り方向を知らせるプロンプトが表示されたら、[実行オプション]画面で[列]または[行]を選択します。個々のウェルまたは列と行のヘッダーをダブルクリックして、情報のテーブルを提供することで、各サンプルの許容される液滴の数を決定します。ddTRAP の場合、10,000 個以上の液滴を含むサンプルは、さらなる分析に有効です。
サンプル複製と NTC サンプルを表すウェルを強調表示します。画面左下のしきい値を設定するためのアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。このプロトコルでは、テロメラーゼ活性は、肺癌およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞の9つの細胞株からなる細胞パネルで測定した。
SHP77、H2887、およびNTCの3つの生物学的複製すべてに対して、約2,000の蛍光振幅に閾値を設定しました。陽性液滴は、6,000の蛍光振幅の周りに蛍光強度を有し、上部に明確な集団を形成し、1,100の蛍光振幅の周りの負の液滴から分離した。全てのサンプル間の細胞当たりの全テロメラーゼ伸展産物は、肺癌株におけるテロメラーゼ活性を表す核酸の測定濃度から推定した。
リソヌクレオ蛋白質複合体であるため、リシスまたは拡張反応ステップ中のRNase汚染は、テロメラーゼ酵素活性を破壊します。ddTRAPは、細胞内のhTERT mRNA発現レベルに対するddPCRをフォローアップすることができる。2つのデータセットにより、hTERTの発現をテロメラーゼ活性と相関させ、代替スプライシングなどの潜在的なテロメラーゼ調節機構を深く掘り下げることが可能になります。
特定のスプライシング因子の操作とテロメラーゼ活性への影響を調べることができます。現在、テロメラーゼ活性を標的とする潜在的な薬剤としてオリゴヌクレオチドスプライシングモジュレーターを設計しています。
