化学療法誘発性粘膜炎のこのモデルは、マウスの小腸損傷および代償性過剰増殖の重要なエンドポイントおよび増殖マーカーを決定するために使用することができる。この方法は、時間とコスト効率が良く、実行しやすいです。このような標準化された方法では、少数のバリエーションを持つ分析エンドポイントを比較する方が簡単です。
5-フローラウラシルまたは5FU粘膜炎誘導の場合は、適切な体積5FUで19ミリメートル針で27ゲージを装備した1ミリリットルの注射器をロードし、手動でレシピエントマウスを拘束します。しっかりとした、穏やかなグリップでマウスを維持しながら、動物の腹側を露出し、腹部の下の象限の1つ内の歯内腔に針を挿入します。次いで、正しい針の配置を確保するために吸引し、5FUを注入する。
適切な実験エンドポイントで、4-ブロモデオキシウリジンまたはBrdU定量は、5FU負傷動物マウスの重量を量り、煙のフードで腹腔内注射によってBrdUのキログラムあたり5ミリグラムを提供する。BrdUの発令から150分後、つまみつまみに対する応答の欠如を確認し、麻酔マウスの体重を記録し、動物をsupine位置に置きます。腹腔を露出させるために腹腔切開術を行い、胸腔の切開を行い、気胸を導入します。
パイロラスよりも優れた切削を行い、盲腸に達するまで腸組織を動物から引き離して慎重に抽出する。鉗子を使用して、近位内腔を静かに締め付け、25ゲージの針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、小腸を生理食塩水で洗い流します。その後、空になった腸をきれいなブロッティングペーパーの上に置き、余分な塩溶液を慎重に取り除きます。
組織の採取のために、ちょうど実証したように注入された動物から小腸を収穫し、フラッシュされた組織の重量を記録する。組織学的処理後、その組織は、カメラに接続された光顕微鏡の10倍の目的の下で画像化され、採取した組織の組織学的写真を得ることができる。BrdU免疫反応性細胞の面積を測定するには、画像Jで目的の画像を開き、マイクロメータ画像のステージを開きます。
直線選択ツールを使用して、マイクロメータ画像に直線を描画して、既知の距離を定義し、分析メニューでセットスケールを選択します。既知の距離ボックスに値を入力し、長さの単位ボックスで長さの単位を定義します。対象の画像を開いて、クリプト当たりのBrdU免疫反応細胞の面積を測定し、画像タイプメニューの下でカラーグラフィックスを8ビットに設定します。
プロセス強化されたコントラストの下で画像のコントラストを上げ、飽和ピクセルを0.4%に設定して、画像にしきい値を適用して、免疫陽性をセグメント化し、画像調整を選択します。しきい値と赤を選択し、しきい値バーを移動して 10 ~ 20% 前後のしきい値を選択します。次に、適切な暗号を選択し、フリーハンド選択ツールを使用して、その周囲の領域をマークします。
しきい値領域を測定するには、[解析]タブを開き、[パーティクルを解析]を選択します。[パーティクルの解析] ウィンドウで、サイズを 20 に設定して、ボックスのピクセル単位をクリックします。円形状を 0 に設定し、表示をアウトラインに設定します。
次に、表示結果、集計、および穴を含むボックスをクリックします。測定結果がサマリーウィンドウに表示されます。納骨深度を測定するには、禅光で画像を開き、カメラに接続します。
20xの目的でカメラモードでスナップショットを撮り、処理モードに切り替えてスナップショットを開きます。メジャー ビューに切り替えます。ラインツールを使用して、よく向いている納骨堂の下部でラインを開始し、納骨堂の上部でラインを仕上げます。
次に、測定値をエクスポートし、深さとして、奥深さと充填の平均を計算します。小腸の体重は2日目から4日目まで減少し、腸球量の損失を示唆している。なお、5日目までには、治療動物の体重が0日目の重量と有意に変わらない。
BrdUの組み込みによる測定された増殖は1日目と2日目でほぼ廃止されるが、4日目と5日目では、それぞれ約4倍と5倍の増加がある。この過剰増殖は、深さの深さを測定する際にも観察される。粘膜炎の再生期には、急性期に観察されないBrdUの取り込みと深さの間に強い相関関係があり、終点として深さの深さを使用することが粘膜炎の急性期に適している可能性があることを示唆している。
トランスジェニックマウスは、L細胞分泌が不十分で、野生型5−FUマウスで観察されたものと比較して、回復段階における体重の有意な喪失および小腸体重の減少を示す。さらに、トランスジェニックマウスは、陰窩が野生型マウスおよび健康な対照の両方よりも有意に短いため、代償性過剰増殖を示すことができない。この手順を試みている間、小腸を完全に空にし、組織を計量する前に余分な生理的な生理を取り除き、小腸の体重のみを得るようにしてください。
このビデオを見た後、小腸の損傷の重要なエンドポイントを実施、収集、および決定する方法をよく理解する必要があります。そして、再現性のあるデータを効果的に取得する。5FUやBrdUなどの化学化合物を使用することは危険であり、ラボコート、手袋、ヒュームフードの使用などの予防措置は、これらの手順を実行する際に必ず取られるべきであることを忘れないでください。
