この実験の全体的な目標は、私たちの後肢虚血モデルは、推定血管新生剤の機能的、組織学的および分子的効果の包括的な評価のための基礎を実験に照らすることです。このプロトコルは、臨床文脈における将来の応用の可能性を持つ小さな動物モデルにおける可能な血管新生療法の試験のための標準をフィールド化する。血管新生は、重要虚血患者の20~30%では血管形成が適さないため、虚血部位における血液拡散を改善するための新たな戦略として浮上している。
この実験的プロトコルは、血管新生療法がそれぞれの結果におけるその有効性の尺度においてその効果を発揮するメカニズムの包括的な理解を提供することができる。生後22週のC57ブラック6メスマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、右後肢から髪を剃り、加熱されたパッドの上の下肢からキュービタスの位置に動物を固定します。動物を解剖顕微鏡の下に置きます。
そして、右後肢の太ももの上に1センチメートルの皮膚切開を行うために数11の外科メスの刃を使用してください。鈍い神経血管束を露出させるために皮下脂肪を解剖する。尖った鉗子、ばねはさみ、および眼科針ホルダーを使用して、膜状の回腸鞘を開き、遠位外腸骨および大腿骨血管を露出させる。
神経から動脈と静脈を解剖して分離した後、7つのO非吸収性ポリプロピレン縫合糸を使用して、遠位大腿動脈および静脈および遠位外腸骨動脈および静脈をリゲートする。遠位外部腸骨動脈の同定と遠位外腸骨、大腿動脈および静脈の結紮および切除は、処置の成功にとって重要である。バネはさみを使用して、近位と近位の結び目の間の骨位動脈と静脈のセグメントを横断します。
そして、吸収性縫合糸で切開を閉じます。その後、腹腔間で動物に抗鎮静液を送り込み、完全回復までモニタリングしてマウスを自宅のケージに戻します。胃頭筋を収穫するには、両方の後肢から皮膚を取り除く。
そして、綿棒を使用して、筋肉から皮膚を分離します。アキレス腱を保持し、脛骨と脛骨から膝関節まで筋肉を分離するためにスプリングハサミを使用します。そして、上腕二頭筋を胃頭筋から分離する。
春のはさみを使用して、膝関節レベルで胃腸筋の挿入をカットします。そして、小さなコルクディスク上の横方向に収穫した筋肉を配置するために10%トリガサンスを使用してください。その後、液体窒素で試料を凍結し、マイナス80°Cの貯蔵のためにイセプタンを冷却します。
毛細管マイクロディセクショニングレーザーキャプチャの場合、筋肉標本の12マイクロメートルの切片を得た後、マイナス20度の摂氏で5分間冷却された純粋なアセトンの50ミリリットルのスライドに組織を固定します。空気乾燥後、疎水性ペンで各標本を丸で囲みます。そして、4°CでPBSで2モル塩化ナトリウムでサンプルを水分補給します。
再水和の終了時に、目的の適切な一次抗体を一晩で摂氏4度で標識します。その後、PBSで1回の洗浄につき2回の塩化モルナトリウムを2回洗浄する。2回目の洗浄後、示されているように、4°Cで30分間適切な二次抗体でセクションにラベルを付け、続いてPBSで塩化ナトリウムに2回の洗浄を行います。
次に、アビジン共役ペルオキシダーゼ複合体を摂氏4度で30分間ラベル付けします。続いて、DABペルオキシダーゼ基材で洗浄し、5分間の標識を行った。インキュベーションの終了時に、90%エタノールおよび100%エタノールエマースを順次氷冷で組織を脱水する。
次いで、後のマイクロディスセクションシステムを使用し、固体355ナノメートルレーザーへのパルスを装備して、マウスあたり10,000個の毛細血管を解剖し、解剖毛細血管をマイクロフュージチューブ粘着キャップにカタパルトする。図示したように、後肢灌流の完全な喪失は、後肢虚血誘導直後に観察される。血流量の定量的評価は、ISCとNISCの肢の比率として表され、HLI後15日目および45日目にプロ血管新生刺激にさらされたマウスにおける四肢灌流の有意な増強を示した。
胃頭筋組織切片の組織学的切片におけるCD31陽性毛細血管の定量化は、虚血性の血管密度が虚血性において非虚血性肢に対して大きいことを示す。予想通り。しかし、この効果は、プロ血管新生剤での治療後にさらに増幅される。
副次的な血管密度も一貫して虚血性肢で増加し、この増加は、プロ血管新生刺激で曝露した後に有意に高い。CD31陽性内皮細胞におけるプロ血管新生遺伝子発現の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応解析は、プロ血管新生剤に曝露されたマウスまたは非存在のマウス間の遺伝子発現の明確な変化を示す。血管解剖中に動脈と静脈の裂け目を避けるために、膜状の腸骨鞘を開くために古い眼科針を使用することが重要です。
この血管は、レーザードップラーベースの灌流測定によって容易に評価された後肢虚血に応答し、毛細血管密度の組織学的定量化により血管形成を評価することができます。
