このプロトコルは、生きている着床前マウス胚にフォトスタチンを適用する最初のものであり、他の3D生理学的系上で光スイッチ可能な薬物を使用する用途に関して。光切り替え可能なフォトスタチンは、微小管の成長を空間と時間内で操作し、オフ状態に戻すことを可能にする。実験前に意図せずにフォトスタチンを青色光にさらすと、時期尚早に活性化される可能性があります。
そのため、サンプルを準備するときは、常に完全な暗闇または赤色光の条件下で作業することをお勧めします。厳しい暗条件下では、照明に赤色光のみを使用して、超純水中でPST-1Pのストックおよび中間作業溶液を作り始めます。テキスト原稿に記載されているように。
次いで、40の最終濃度を達成するように新鮮なKSOMでPST−1Pを希釈し M.To、ライブイメージング用のチャンバースライドを調製し、1つのウェルの中心に10LのPST−1P処理KSOMを加え、半球状液滴を形成した。液滴が蒸発するのを防ぐために、十分な鉱物油でそれを覆います。次いで、調製した培養皿を箔で緩く包むか、または培養皿をインキュベーター内の非気密不透明な容器に入れて、光曝露がないようにする。
胚をPST-1P処理KSOM滴に移した後、胚が液滴の中央に集まっていることを確認し、皿の底に沈降させる。液浸対物レンズを準備したら、チャンバースライドを環境チャンバー内の顕微鏡に取り付けます。すべてのPST-1Pが非アクティブなトランスコンフィグレーションにあり、胚が皿の底に沈むことができるように、37°Cと5%CO2に設定し、完全な暗闇の中で設定します。
赤色光トーチを使用して、対物レンズを液浸媒体に接触させるように配置します。次に、媒体の液滴の端を見つけて、その上に目標を直接配置します。ライブスキャンモードと561nmレーザーを使用して、液滴内の胚を見つけます。
ステージコントローラとライブスキャンモードを使用して、胚全体のzスタックを取得するための開始点と終了点を設定します。信号に応じて、レーザー出力設定を最大5%まで調整します。また、信号に応じてデジタルオフセットを最大0.900に設定して、EB3-dTomato彗星の外観を最適化します。
バックグラウンドノイズを最小限に抑えます。ピンホールを 2 m に設定します。512 x 512 のピクセル解像度。
そしてピクセルの滞留時間は3.15秒です。ズームを2倍に設定します。生物全体の微小管成長の領域を評価するために、1mのセクション間隔で胚全体のzスタックを取得する。
EB3-dTomato彗星追跡実験では、3D Zスタック画像を開き、ズームを3倍に増やします。そして、関心のある特定の細胞内領域の周りに長方形のROIを描画する。次に、設定されたパラメータを使用して、500msの時間間隔で、単一のz平面のタイムラプスムービーを取得します。
PST-1Pをアクティブにするには、405nmレーザーに切り替えて、レーザーを10%パワーに設定し、ピンホールを最大に開き、ピクセル解像度を512×512、ピクセルドウェル時間を3.15秒、ズームを3回、500ミリ秒の時間間隔で、20フレームを取得するように設定します。活性化直後は561nmレーザーに切り替え、前述のように取得を繰り返し、PST-1Pの活性化後のEB3-dトマト彗星の損失を確認した。次に、PST-1Pを逆にして非アクティブなトランス状態に戻し、514nmレーザーを作動させ、設定されたパラメータで別のタイムラプスを集録します。
EB3-dトマト彗星の回復を可視化するには、561nmレーザーに切り替えて取得を繰り返します。未処理の対照胚では、405nmレーザーによる照射前に、EB3-dTomatoシグナルは核領域を除く細胞の細胞質全体内で高かった。照明後、信号の変化は検出されなかった。
405nmレーザーが胚または微小管ダイナミクスに光損傷を引き起こさなかったことを示す。16細胞期胚のPST-1P処理中、厳密な暗条件下では、強いEB3-dトマト発現が3D画像で検出され、不活性なPST-1Pが暗条件下で微小管重合の阻害を誘発しないことを実証した。PST-1Pの活性化前に、単一のz面のタイムラプスイメージングにより、強いEB3-dTomato発現、および細胞内領域での微小管重合が確認された。
405nmの光活性化後、数秒以内にEB3-dTomato彗星シグナルの減少が検出された。そして、514nmレーザーを用いてPST-1Pを失活させた際に信号の回復が達成された。EB3−dTomatoをマイクロ注射した胚を、PST−1Pと共にインキュベートして、正常な胚電位を示し、胚盤胞期まで発達した。
有糸分裂中の正常な微小管動態。胚に対する活性型PST-1Pの非毒性を示す。取得したタイムラプス映画では、EB3-dTomatoラベリングが彗星のような構造として現れ、成長する微小管フィラメントの追跡を可能にした。
暗条件下で保たれたPST−1P処理胚において、個々のEB3−dTomato彗星は、初期マウス胚において非セントロソーム微小管組織化中心として作用する相間架橋から発せられた。tスタックは、相間架橋の領域におけるEB3-dトマト彗星を示す。PST-1Pの活性化後、EB3-dトマト彗星は相間架橋の基部とtスタックで減少した。
白色光はPST-1Pを時期尚早にアクティブにする可能性があることに注意してください。したがって、視認性のために赤い光源のみを使用してください。緑色の光はPST-1Pも無効にしますので、緑色の蛍光標識マーカーの使用は避けてください。
この技術は、ショウジョウバエ、アメーバ、マウス、および複数のin vitro系において、細胞移動および組織形成を研究するために微小管増殖を標的とするために使用されてきた。
