このプロトコルは、継代なしで生成される記憶上皮オルガノイドの産生にとって重要である。この技術の主な利点は、酵素消化後にヒトおよびマウスの乳房および記憶組織からオルガノイドを単離できることです。私たちは、細胞を継代することなく上皮オルガノイドを単離する一連の差動遠心分離ステップを実行します。
この技術を実行する個人は、組織をコラーゲンまたはマトリックスに埋め込み、96ウェルプレート内にプレーティングするときに課題に直面する可能性があります。さらに、適切に重合されたコラーゲンを使用し、安定したドームをメッキすることが、侵入を見るための鍵です。まず、マウスの手足を広げ、4本の19ゲージ針を使用して安楽死させたマウスの乳腺組織を収集し、腹側を上に向けて吸収パッドで覆われたボードにマウスを足で固定します。
70%エタノールをスプレーして毛皮を滑らかにし、皮膚を消毒し、ガーゼパッドまたはティッシュで糞便を拭き取ります。肛門生殖器領域のすぐ上から始めて、腹膜を突き刺さないように注意しながら外科用ハサミを使用して正中線から上向きに切ります。あごに到達したら、鎖骨と後ろ足の両方を横方向に切り込み、マウスの皮膚をボードにぴんと張って固定して乳脂肪パッドを露出させます。
野生型マウスの鼠径部および胸部の乳腺脂肪パッドを見つけた後、鉗子を使用して乳脂肪パッドを上昇させます。鋭い鈍いはさみの鈍い端を使用して、乳房脂肪パッドの下に皮膚から離れたポケットを作成し、乳房脂肪パッドを1つの完全な部分に切り取ります。乳脂肪パッドを取り除いたら、PBSですすいでから滅菌組織培養皿に入れ、すぐに組織培養フードに移します。
乳腺腫瘍を10番または11番のメスで細かく刻み、ペースト状の粘稠度に達するまで組織をほぐします。メスを使用して、ミンチ組織を10〜30ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む円錐管に移します。すべての組織を確実に収集するには、1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を組織培養プレートにピペットで移し、円錐形チューブに戻します。
組織が糸状になり、コラゲナーゼ溶液が濁るまで、円錐形のチューブをベンチトップの振とうインキュベーターに入れます。50ミリリットルの溶液を1, 500 RPMで5〜10分間スピンダウンします。上清を吸引し、基礎培地を12ミリリットル加え、上下に3〜4回ピペッティングして混合するか、チューブを15回保持しながら手首を静かに回転させる。
ここでも、吸引上清をスピンダウンし、基礎培地を添加し、前に示したようにピペッティングまたはチューブ回転によって混合します。最も重い組織片が底に落ち着いたら、血清学的ピペットで上清を集め、それを15ミリリットルの円錐管に移します。各遠心分離の後、ペレットがますます不透明になることを確認してください。
ウェルあたりのBECM量に対するオルガノイド密度に応じて、オルガノイドの適切な懸濁液を微量遠心チューブに分注します。微量遠心チューブを室温で300 Gで10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットの入ったチューブを氷に移し、各微量遠心チューブに適切な量のBECMを加えます。
気泡が発生しないように注意しながら、ゆっくりと上下にピペットでオルガノイドをBECMに再懸濁します。BECM懸濁オルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで固定し、湿度を維持するためにすべての空のウェルにPBSを満たします。プレートを摂氏37度のインキュベーターに1時間置き、BECMを固化させてから、適切な量の培地で覆います。
コラーゲン溶液を調製するために、DMEMの10倍の濃度の375マイクロリットル、100マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウム、および3ミリリットルのラット尾コラーゲンI溶液を15ミリリットルの円錐管に入れる。泡を作らないように注意しながらピペットミックスし、必要に応じて少量の水酸化ナトリウムまたはDMEMの10倍の濃度で溶液を7.2〜7.4のpHに滴定します。少量のコラーゲンを入れてウェルの底を完全に覆うのに必要な最小限の量のコラーゲンでウェルの底をコーティングし、プレートを左右に揺り動かしてコーティングします。
コラーゲンの下敷きを摂氏37度に30分から2時間設定します。ウェルあたりのコラーゲン量に対するオルガノイド密度に応じて、オルガノイドの適切な懸濁液をマイクロ遠心チューブに分注します。コラーゲン溶液を摂氏4度で保存し、10分ごとに顕微鏡で繊維形成をチェックして重合を監視します。
マイクロ遠心チューブを室温で300Gで10分間遠心分離し、チューブから上清を廃棄します。オルガノイドペレットを氷に移し、各微量遠心チューブに適切な量のコラーゲンを加えます。オルガノイドをコラーゲンに再懸濁させるためにゆっくりと上下にピペットで、泡が出ないように注意します。
コラーゲン懸濁オルガノイドをゆっくりと慎重にめっき表面にピペットで貼り付けます。基底細胞外マトリックスまたはコラーゲンのいずれかに埋め込まれたオルガノイドの免疫蛍光画像は、種間組織組成の類似性を研究するために得られました。コラーゲンマトリックスに埋め込まれたオルガノイドは、浸潤アッセイに使用でき、膜トマト標識またはアクチンのファロイジン染色のいずれかを介して、オルガノイド自体から分岐する巻きひげの膨張を追跡することによって分析できます。
最後に、パラフィン包埋オルガノイドのヘマトキシリン染色とエオジン染色は、オルガノイドが乳がんの同じ組織像を維持していることを示しています。早期重合を避けるために、ゲル化されたドームをピペッティングしている間、BECMとコラーゲンを冷たく保つことが重要です。さらに、PFAでのドームの長時間の固定は、免疫蛍光染色を行う場合、ゲル化された溶液につながります。
オルガノイドは、薬物スクリーニングや転移のマウスモデルなどのインビトロおよびインビボの手順でも使用できます。これらの方法は、腫瘍組織の治療感受性、転移特性、および免疫相互作用に関する洞察を提供することができます。
