前期1の細胞を同期させ、特定の段階で標的タンパク質を枯渇させることで、特定のタンパク質の一時的に異なる機能を特定することができます。筋症の特定の段階で条件付きでタンパク質を枯渇させることは、伝統的な筋変異体が後の段階で持つ可能性のある残留効果を防ぎます。この方法は、出芽酵母有糸分裂および核膜破壊を受けない他の生物を研究するために使用することができる。
さらに、この方法は、核膜破壊前の細胞周期事象を研究するために他の生物で使用することができる。はじめに、イメージング用の細胞の単層を作成するために使用される寒天パッドを作成します。1.5ミリリットルの微小遠心管のキャップと底部の3分の1を切り取って廃棄し、寒天パッドの型となるシリンダーを作成します。
カットしたマイクロ遠心チューブシリンダーを、チューブの上部を逆さまにしてスライドの上に座って、きれいなガラススライドに置きます。50ミリリットルのビーカーに6ミリリットルの5%寒天溶液を作ります。ピペットの先端を切り取って開口部を大きくし、約500マイクロリットルの溶かした寒天をマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。
寒天が固まるまで室温で放置します。酵母細胞を調製するには、200マイクロリットルの胞子形成培養物を800 Gで1ミリリットルの微量遠心チューブで2分間スピンダウンします。180マイクロリットルの上清を捨てる。
チューブを旋回させてフリックすることにより、残りの上清にペレットを再懸濁します。濃縮された細胞6マイクロリットルをConAでその場でチャンバーの中央にあるカバースリップにピペットで入れます。シリンダーを寒天パッドで持ち、スライドガラスから慎重にスライドさせます。
寒天の底部が完全に平らであることを確認し、ピペットチップの底部を使用して、寒天パッドがチューブの境界よりわずかに上に押し出されるように、マイクロ遠心機型にわずかな圧力を加えます。次に、寒天パッドがチャンバーに向かって下を向くように金型を反転させます。鉗子を使用して寒天パッドを細胞の上にそっと置き、ピペットチップを使用して寒天パッドをチャンバーの周りに10〜20回静かにスライドさせて、カバースリップ上に細胞の単層を作成します。
寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間保持します。次に、2ミリリットルの胞子形成培養物を2つの微量遠心チューブに移し、15, 700 Gで2分間回転させます。上清をきれいな微量遠心チューブに移した後、同じ条件で再度回転させ、上清を回収して微量遠心チューブを洗浄します。
2ミリリットルの上清を寒天パッドを含むチャンバーに滴下する。液体がチャンバーの上部に到達すると、寒天パッドはおそらく浮遊します。寒天パッドを鉗子でそっと取り外し、廃棄します。
イメージング中の蒸発を防ぐために、チャンバーの上部に24 x 50ミリメートルのカバースリップを置きます。顕微鏡で動画を設定するには、スライドホルダー内にカバースリップをはめ込みます。成形粘土をカバースリップの側面に接着して、スライドホルダーにしっかりと固定します。
画像取得ソフトウェアを開きます。粗い調整ノブと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。画像取得ソフトウェアのメインメニューで、[ファイル]をクリックし、[取得]を選択すると、4つのウィンドウがポップアップ表示されます。
[3Dを解決]という名前のウィンドウで、三角フラスコアイコンをクリックします。これにより、[実験の実行] というタイトルのウィンドウが開き、タイムラプス ムービーを設定するための実験を設定するためのコントロールが含まれています。[デザイン]タブで、[セクショニング]というラベルの付いたタブに移動します。
Z断面の横のボックスを選択し、光学セクションの間隔を1マイクロメートルに、光学セクションの数を5に設定します。次に、[チャネル]タブでプラスアイコンをクリックして、適切なチャネルを選択します。次に、[参照画像] の横にあるボックスを選択し、ドロップダウン メニューから Z 位置をサンプルの中央に設定します。
ドロップダウンメニューから透過率と露光時間の値を選択します。[タイムラプス]タブで、[タイムラプス]の横にあるボックスを選択し、分と時間の値を入力して、画像取得の時間間隔を指定します。「究極のフォーカスでフォーカスを維持」の横にあるボックスを選択して、ムービー中のステージドリフトを防ぎます。
[ポイント]タブで、[ポイントリストを訪問]の横にあるボックスを選択します。メインメニューで、[表示]をクリックし、[ポイントリスト]を選択します。細胞の単層を示すチャンバーの領域にステージを移動します。
[ポイント リスト]ウィンドウで[ポイントをマーク]をクリックします。ステージを移動して、重なり合うことなく 25 から 30 のポイントを選択し、セルの露出オーバーを防ぎ、各タイム コース中に各フィールドを画像化します。[ポイント リスト]ウィンドウで、[すべてキャリブレーション]を選択して、各ポイントの最終的なフォーカスを設定します。
[ファイル名を指定して実行] タブで、コンピューター上の適切な保存先にファイルを保存します。[実験の実行] ウィンドウで、[再生] ボタンを選択してムービーを開始します。フィジーソフトウェアを開きます。
DIC チャンネルと mCherry チャンネルを開きます。[画像]、[スタック]、および[Z Project]の順にクリックして、mCherryチャネルの単一の最大強度投影を取得し、ドロップダウンメニューから[最大強度]を選択します。DICチャンネルとmCherryチャンネルを1つの画像にマージするには、[画像]、[カラー]をクリックし、[チャンネルのマージ]を選択します。
減数分裂を通して単一の細胞をたどります。減数分裂IIの完了後、DNA質量の数を記録します。アンカーアウェイの背景を持つ野生型細胞では、減数分裂IIの終わりに通常4つのDNA塊があり、減数分裂の4つの産物を表しています。
減数分裂II期にCtf19-FRBが固定されている場合、減数分裂の完了時に約47%の細胞が4つ以上のDNA塊を示し、動原体と微小管の付着に欠陥があることが示唆されています。Ctf19-FRBを固定すると、動原体集合後、減数分裂Iの前、または減数分裂IIの後に、約16%の細胞が追加のDNA量を示します。このプロトコルの最も重要な部分の1つは、単層が破壊されないように、上清をチャンバーに滴下することです。
さらに、イメージングの準備に必要な時間をメモして、分析で考慮します。蛍光パックされたタンパク質を変更することにより、この手順を使用して、細胞周期の持続時間、染色体分配、タンパク質の存在量、およびタンパク質の局在に関する質問に答えることができます。
