ライブセルイメージングにより、単一の細胞内での時間の経過に関する動的な細胞プロセスの観察が可能になります。これらのアプローチは、細胞分裂の動的プロセスに影響を与える条件を評価し、有糸分裂の欠陥が娘の細胞増殖および生存可能性に及ぼす影響を明らかにするのに強力である。イメージング中に光暴露から生じる光毒性は、このプロトコルに関連する重大な課題を表す。
したがって、露光時間とイメージング間隔と持続時間を最適化する必要があります。無菌技術とバイオセーフティレベル2安全キャビネットを用いて、滅菌使い捨てガラスパスツールピペットを用いて、目的とする発現構成体を担う細胞株を含む培養板から培地を吸引する。渦巻きで10ミリリットルの無菌PBSで細胞を簡単に洗い、0.05%トリプシンの2ミリリットルで細胞を治療します。
摂氏37度で2~5分後、新鮮な培地を8ミリリットルプレートに加えて反応を止め、切り離した細胞を穏やかなピペットで再中断します。細胞溶液を無菌15ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって細胞を採取する。10ミリリットルのPBSでペレットを再懸濁し、細胞を再び遠心分離する。
ペレットを計数用の培地10ミリリットルに再懸濁し、細胞培地濃度のミリリットル当たり5番目の細胞に1〜2倍に希釈する。次に、無菌12ウェルイメージング底板の各ウェルに500マイクロリットルの細胞をシードし、細胞培養インキュベーターにプレートを入れて、細胞がプレートの表面に付着できるようにします。イメージングの30分以上前に、1つ以上のウェルに有糸分裂性薬物の関連濃度を加え、コントロールと同じ数のウェルに同量の阻害剤希釈剤を加える。
顕微鏡をイメージング用に準備するには、高解像度カメラ、摂氏37度に予熱した環境室、加湿5%の二酸化炭素の送達システムを備えた反転性蛍光顕微鏡のステージにプレートを置きます。0.5の数値開口で20倍の空気の目的を選択し、高コントラスト蛍光と位相コントラスト、または明視野イメージングを装備し、細胞を見てコースを調整し、焦点を合わせて細胞を焦点にします。明視野、GFP、および RFP 画像取得の最適な露光時間を設定するには、画像化されるフルオロフォアに対して適切な励起と放出を持つそれぞれのフィルタ キューブを選択し、[再生]をクリックします。
信号が十分に強くない場合は、自動露出を調整し、各フルオロフォアチャンネルで[フォーマット]ドロップダウンメニューから適切なビンを選択します。メーカーの指示に従って顕微鏡のステージをマルチウェル皿に合わせて選択し、キャリブレーションし、画像取得ソフトウェアを使用して、画像化されるウェルをハイライトまたは選択します。生成されたポイントコントロールパネルを開き、[作業領域]で[制限]と[境界線]を選択して、座標選択領域を制限して、ウェルの境界を除外します。
[エリア制限] ドロップダウン メニューで、[エリア全体] を選択し、ランダムなポイント配置を選択します。カウントを 6 に設定し、[ランダム化] をクリックして、それぞれウェルごとにキャプチャするポイントの数と分布を選択します。次にクリックし、時間シーケンスコントロールパネルに値を入力して、画像を収集する時間間隔と期間を選択して入力します。
RFP-H2B標識クロマチンを可視化するには、RFPフィルターキューブで撮影した画像を所定の位置に選択し、初期クロマチン圧縮と核エンベロープ分解によって示されるように有糸分裂に入る細胞を特定し、個々の細胞におけるメタフェーズアライメントおよび解相発症の有糸間合動のタイミングを決定する。取得したムービーの連続したタイムポイントを通して対象のセルを追跡し、裂実エントリから、RFP-H2Bラベル付きクロマチンがメタフェーズ中に細胞赤道でのアライメントを完了するまでの時間ポイントまたは分数を決定します。有糸分裂のタイミング、有糸の忠実さ、および細胞の運命を監視するために、連続した時間ポイントを通して細胞を追跡し続け、解相染色体分離が明らかである時間座標および/またはクロマチン脱圧縮および核エンベロープの改変が起こった時を特定する。
次に、RFP-H2Bを可視化して、アナフェーズ染色体分離中の遅れた染色体やクロマチン橋を含む、有糸分裂欠陥を示す各集団の細胞を同定する。αチューブリン-EGFPを可視化することにより、紡錘の破砕を経験した細胞は、スピンドルプルの焦点合わせが達成され、細胞分裂に備えてバイポーラ有糸状紡錘が形成されるとともに動的変化を起こすのが観察できる。スピンドルアセンブリと同時に、染色体の動きをRFP-H2Bで視覚化して、染色体のアライメントと分離の忠実度を評価することができます。
これらの代表的な結果は、生細胞イメージングアプローチを用いて、正常なセントロソーム含有量を有する細胞が、30分以内に双極性分裂を達成するために、メタフェーズアライメントおよびアナフェーズ発症を通じて核エンベロープの分解から進むことができることを示している。余分なセントロソームの存在下では、細胞のほぼ50%が一過性多極有糸分裂スピンドルを克服し、完全な細胞分裂における双極性紡錘を形成することができる。残りの細胞は双極スピンドルを達成することができず、その結果、多極分裂を通して有糸分裂を抜ける。
スピンドル双極性が達成されるかどうかにかかわらず、余分な中心性を有する細胞は、2つのセントロソームを有する細胞と比較して有糸分裂の有意に増加した持続時間を示す。有糸分裂性転帰の変化が明らかでない場合でも、有糸分裂性進行のダイナミクスが変化する可能性があることを示す。蛍光チャネルの露光時間を定義する場合は、光毒性を制限するために、露出時間を最適化します。
また、カメラピクセルビンを選択して、より低い露光時間を使用できるようにすることもできます。この手順は、薬理学的スクリーニング、浸潤、および移行分析における適用を有する。これらのアプローチはまた、薬物治療の有効性または細胞運動のダイナミクスを調べるために使用することができる。
