OCTは質量分析と両立しない凍結保存剤です。このプロトコルを使用すると、研究者は組織からOCTを除去し、タンデム液体クロマトグラフィー質量分析でスフィンゴ脂質を定量できます。組織乾燥芯の準備、組織洗浄、および組織計量は、バージニアコモンウェルス大学のエイプリルボイドによって実証され、脂質抽出は、バージニアコモンウェルスメタボロミクスおよびリピドミクスコアのディレクターであるジェレミーアレグッド博士によって実証されます。
まず、外科用ハサミをメタノールに5分間浸してきれいにし、次にきれいな実験室グレードのティッシュで拭きます。パウダーフリーの手袋を使用して、実験室グレードのティッシュの端を回転させて、細かく先細りの30〜40ミリメートルの長さの芯を作成します。次に、メタノールで洗浄したはさみを使用して、厚い端の芯を切り、きれいな段ボール箱に入れます。
次に、メタノール洗浄ハサミを使用して、1ミリリットルのピペットチップの先端から4〜5ミリメートルを切り取り、チップホルダーに戻します。組織からOCTを洗い流すには、人間の肺組織を含む各チューブに10ミリリットルの氷冷超高純度脱イオン水を加え、しっかりと蓋をします。チューブを10分間インキュベートします。
チューブまたは組織ペレットの壁に堆積したすべての組織が完全に再懸濁されるまで、各チューブを激しくボルテックスします。次に、摂氏 4 度で 10 分間、 4 、 000 〜 5 、 000 倍の G でプレチルドスイングバケット遠心分離機でチューブを遠心分離します。遠心分離が完了したら、氷上でチューブのキャップを外します。
洗浄液を慎重に吸引し、チューブ内に約0.5ミリリットルの上清を残してから、チューブをキャップします。すべてのチューブから上清を除去した後、同じ方法で組織をさらに2回洗浄します。OCT除去を3回洗浄した後、準備した短縮ピペットチップを使用して、500マイクロリットルの氷冷PBSをチューブに加えます。
同じチップを使用して、ペレットを静かに再懸濁し、再懸濁したすべての組織を、事前にラベル付けされ、事前に計量された1.5ミリリットルの遠沈管に移します。すべての組織サンプルが移されるまで、チューブを氷上に置いておきます。事前に冷却された遠心分離機でチューブを遠心分離して組織をペレット化し、ペレットを乱さずにできるだけ多くのPBSを注意深く吸引し、チューブを氷上に戻します。
前に準備したティッシュ乾燥芯を使用して、残っている洗浄液をそっと取り除き、チューブを閉じて氷の上に置きます。チューブの重量を量るには、最近校正されたタール処理およびゼロ分析天びんに一度に1本のチューブを置き、チャンバーのドアを閉じます。体重が安定したら、電子スプレッドシートに記録します。
計量後、チューブを氷上に戻し、300マイクロリットルの氷冷PBSを加えます。短くしたピペットチップを使用して、すべての組織を、事前にラベル付けされたスクリュートップガラスチューブ内の2ミリリットルの氷冷メタノールに慎重に移します。脂質抽出の前に、組織および質量分析の内部脂質標準物質を室温に20分間平衡化させ、次に脂質標準物質が完全に溶解するまで内部標準物質溶液をボルテックスして超音波水浴に浸します。
繰り返しピペットを使用して、内部質量分析標準の250ピコモルを各チューブに追加し、チューブを軽く要約します。均質化を容易にするために、メタノールの容量を2ミリリットルに調整し、次にホモジナイザーの先端をチューブ壁にそっと押し付けて円を描くように動かして、ホモジナイザーを使用して組織を粉砕します。塊が見えなくなったら、チューブを要約します。
チューブを超音波水浴に45度の角度で5〜10秒間浸します。次に、ヒュームフードの下で、各チューブにクロロホルムとメタノールを追加して、メタノールとクロロホルムと水の比率を2対1から0.1にします。チューブをしっかりと密封し、一日の終わりまでベンチトップに置いておきます。
その夜出発する前に、しっかりと蓋をしたチューブを摂氏48度の水浴に入れて一晩インキュベートします。翌日、任意の溶媒および可溶性破片を遠心分離によりペレット化する。次に、ヒュームフード内で、上清を事前にラベル付けされた13に慎重にデカントし、デカンテーションを容易にするために30〜45度の角度で傾けた100ミリメートルのホウケイ酸ガラス試験管に入れます。
すべてのチューブから上清をデカントした後、最大真空で真空濃縮器を使用し、摂氏40度で最初の1時間の加熱ステップですべての溶媒を蒸発させ、次に各チューブに500マイクロリットルのメタノールを追加します。乾燥した脂質抽出物を再懸濁するには、チューブを5〜10秒間ボルテックスしてから、チューブを45度の角度で2分間回転させて超音波水浴に浸します。チューブを5秒間再ボルテックスし、さらに1分間超音波水浴に再度浸します。
遠心分離によって不溶性の破片を取り除き、デカンテーションを容易にするために、上清を30〜45度の角度で傾けた事前にラベル付けされたオートインジェクターバイアルにデカントします。分析するまで摂氏マイナス80度で保管する前に、バイアルをしっかりと蓋をしてください。OCT除去後の液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析分析により、ヒト肺腺癌腫瘍では、正常な隣接非関与組織と比較して、さまざまな鎖長種のセラミドおよびモノヘキソシルセラミドが有意に上昇していることが確認されました。
スフィンゴ脂質標準物質は、d17:1スフィンゴシン、d17:1スフィンゴシン-1-リン酸、C12ラクトシルセラミド、C12モノヘキソシルセラミド、C12スフィンゴミエリン、C12セラミドの順に溶出します。これらのスフィンゴ脂質種のそれぞれについて、テキストの勾配とインストルメンテーションの設定を使用して、鎖長の2つの炭素増加ごとに保持時間に約0.15分の正のシフトがあります。ただし、C24やC26などの鎖長の長い脂質は、保持時間のシフトが大きくなる可能性があります。
さらに、脂肪酸の二重結合は、保持時間の負の0.15分のシフトをもたらすことがよくあります。したがって、C18:1セラミドの保持時間はC16セラミドと同様です。このプロトコルは、採取したばかりの組織にほぼ独占的に依存するのではなく、質量分析に使用できる組織源を拡張して、バイオリポジトリに極低温で保存された組織源を含めます。
