本研究の全体的な目的は、M1マクロファージ4T1マウス乳腺癌細胞における食作用活性の経時2Dイメージングを得る。このライフセル共培養モデルを確立し、蛍光と差動干渉の対比顕微鏡を組み合わせて観察した。マクロファージによる食作用の評価は、画像であり、イメージングソフトウェアを使用して、我々のインキュベーションをテストする前に、マルチポイントタイムラプスビデオを倍増させた。
マクロファージの行動とがん細胞との貪食活性の磨きのニーズと利点を満たすために私たちが行った問題。具体的にはマウス乳腺癌です。本研究の最初の部分は、4T1マウス乳腺癌細胞とRAW 2647マウスマクロファージの生細胞共培養モデルから始まる。
実験を開始するには、41個のマウス乳腺癌細胞とRAW 2647マウスマクロファージを培養します。まず、4T1およびRAW 2647細胞のバイアルを解凍する。解凍した細胞を15ミル円錐形チューブで10ミリメートルで希釈します。
次に、660gの力で細胞を5分間遠心し、細胞ペレットを得た。慎重に培地を吸引し、完全な培地の8ミルで細胞を再懸濁し、細胞を組織培養フラスコに移す。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。
接着条件下で培養を1週間行った後、フラスコを毎日監視し、必要に応じてatmil完全な培地を補充します。次のステップは、M1偏光RAW 2647マクロファージの免疫染色を継続する。このステップは、M1マクロファージの完全な分極を確保する。
RAW 2647の合流度が70〜80%に達したので、培養培地を廃棄し、PBSで2回穏やかにすすいだ。細胞スクラッパーを使用して接着細胞を静かに取り外し、50ミル円錐形チューブに移すことによって収集するためのマクロファージを準備します。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、残りの溶液を座っている密度に加えて、1皿あたり100,000個の細胞の密度で懸濁した細胞を調製する。
2つのイメージングディッシュに2ミルのマクロファージサスペンションを座ります。細胞を摂氏37度で2~3時間、炭酸ガス5%でインキュベートし、細胞の付着を可能にする。10%FBSを添加した完全な培地に、ミルLPSあたり100ニリグラムと1ミルインターフェロンガンマあたり20ニリグラムを加えてM1偏光培地を調製します。
培養前に培養したマクロファージから上清を捨て、PBSを用いて皿中の単層を2回丁寧に洗う。M1偏光メディアの2ミルをマッチング皿の1つに加え、硬膜細胞がM1マクロファージフィンナタイプに注入できるようにします。免疫染色の前に、4%パラホルムアルデヒドの2ミルを使用してRAWおよびM1マクロファージ細胞を固定し、室温で50分間インキュベートします。
上清を取り除き、PBSを用いて細胞単層を少なくとも3回洗浄する。PBSで塩化50ミリの塩化アンモニウム2ミルでクエンチし、室温で50分間インキュベートします。PBSで0.3%トリトンX-100を室温で50分間使用して透過性を高めます。
PBS室温で30分間、10%FBSを使用したブロッキング工程。抗iNOS抗体をPBSで共役FITCと、摂氏4度で一晩1%FBSとインキュベートする。DAPIの1ミルを、アルミニウム箔で覆うことで暗い状態で摂氏37度で10分間イメージングディッシュにインキュベートします。
PBSを使用して細胞を少なくとも3回洗浄し、DMEMの1ミルをマッチング皿に加え、蛍光イメージングの準備を整えます。次のステップは、4T1マウス乳腺癌細胞の播種を進める。4T1細胞の合流度が70〜80%に達すると、培養培地を廃棄し、PBSで2回やさしくすすめます。
プリウォームドトリプシンを1ミル加えて細胞を関連付け解除し、摂氏37度で最大20分間インキュベートします。細胞が取り付けられていないように見えたら、脱結合した細胞を15ミル円錐形チューブに移します。そして、見られる管を不活性化するために、事前に温めた完全な媒体の2ミルを加えます。
600gの力で5分間遠心分離機を細胞ペレットを得た。上清を取り除き、10ミルプレランサンプリングDMEM培地でペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、100,000個の細胞をミルDMEMに入れておきます。
これらをTC処理でイメージングする。次のステップは、CFSE染色を用いて生きている4T1マウス乳腺癌細胞に標識することです。まず、4T1細胞を播種したイメージング皿から既存の培地を取り除きます。
CFSE染色液を1ミルPBSに希釈して5個のマクマルを作業同意にします。CFSE染色液をイメージングディッシュに1ミル加え、室温で20分間、暗闇の中で37°Cの細胞をインキュベートします。細胞に等しいDMEMと染色溶液を加え、5分間播種します。
次のステップは、4T1でRAW2647マウスマクロファージと共培養をシードすることです。4T1細胞のCFSEレベリング後、PBSを用いてイメージング皿を2回洗浄する。4T1イメージングディッシュにマクロファージ懸濁液の種子2ミル。
次のステップは、Raw 4627マクロファージをM1フィンナタイプに偏極することです。想像皿にM1偏光媒体の2ミルを加え、RAW細胞がM1マクロファージフィンナタイプに注入することを可能にする。研究の第2部は、M1マクロファージ食細胞4T1細胞のタイムラプス評価である。
次のステップには、ライブ細胞ビデオ顕微鏡貪食症評価が含まれます。まず、顕微鏡のスイッチを入れ。摂氏37度の温度を設定します。
そして5%の二酸化炭素ガス。共同培養セルをステージの中央に配置し、上部チャンバーをそっとねじ込みます。ジョイスティックを使用して、キャプチャする別の位置を選択してステージを動かします。
ライブセルイメージングを行う際には、考慮すべき多くの要因があります。かなり小さなビデオを取得します。それは、イメージング露光、時間測定の最適化、および焦点補正の自動化を必要とします。
ビデオが露出し過ぎると、時間間隔が正しくない、また焦点が合っていない場合、ビデオが使用できなくなる可能性があります。これらの要因の1つが検出された場合、実験の繰り返しを行う必要があります。図1は、緑色で抗iNOSで回る免疫蛍光を示す。
青で核マーカーDAPI。そして、ほとんどの画像の拡張バージョン。動画1はM1マクロファージと4T1を理解する代表的なライブセルムービーである。
CFSEは、花のマルチチャネル獲得とIC顕微鏡を用いて捕獲されたほとんどの乳腺癌細胞を共培養した。ムービー2ライブセルビデオ顕微鏡ムービーは、単一の共役皿のマルチポイントから。誘導M1マクロファージによる4T1の貪食を示す。
画像は50分間隔で13時間撮影した。ムービー3ライブセルビデオ顕微鏡ムービーは、M1マクロファージによる4T1の貪食の深さの視覚化を示すために選択された単一の座標点の。赤い矢印はM1マクロファージを示し、黄色の円は4T1細胞のクエンチフルオレンおよびゴフマンの数が4T1細胞であることを示す。
M1マクロファージは、多孔質細胞質として記述されるM1マクロファージは、4T1マウス記憶癌として上皮形態を有する。マクロファージは、細胞間接触を確立するために4T1細胞を追加するために移動するのを見ることができます。その後、M1マクロファージ当たり4T1細胞の取り込みが続きます。
このビデオを見た後、あなたは4T1マウス乳腺癌とRAW 2647 meradマクロファージで、ライブセルビデオ顕微鏡実験を行う方法についてよく理解している必要があります。また、食細胞性エッセイを実行するために、両方の細胞タイプの夜間の共同培養を設定できるはずです。また、LPSとインターフェロンガンママクロファージを持つ4T1の共同カルチュナーについても理解する必要があります。
