このプロトコルは、異なる中枢神経系領域間、ならびに異なる個体間の微小血管系の比較を可能にするため、重要である。このマイクロ容器の分離技術は1日で完了することができ、超遠心分離および酵素解離の必要性を排除する。髄膜および脈絡膜叢を除去することは困難であり得る。
各組織の完全な除去を確実にするためにゆっくりと慎重に動作するようにしてください。小さなリセンサイル脊椎動物標本からのCNS組織解剖の場合、採取した脳を氷上のMV-1溶液を含む15ミリリットルの円錐管に入れ、鉗子を使用して頭蓋骨のセラ・ターシカから下垂体を取り出す。下垂体をMV-1溶液の1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管に氷の上に置き、皮膚と筋肉を取り除いて椎骨柱を露出させる。
手足、胸部および内臓を取り除いた後、18ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、椎骨柱を新鮮なMV-1溶液で洗い流し、腰椎骨の前部を通して尾骨からrostral方向に洗い流す。次に、新鮮なMV-1溶液を含む5ミリリットルのチューブに脊髄を入れる。次に、脳を解剖顕微鏡の下のペトリ皿に入れ、二重突起のプリックで髄を取り除きます。
髄の破片が残っていないかどうかを確認するために、脊髄を確認してください。視床下部、小脳、脳幹、皮質を分離するために鉗子を使用してください。必要に応じて、鉗子と虹彩とバネはさみを使用して嗅球や視床を切除し、二重突っ張りのプリックを使用してすべての脳室から脈絡叢のすべてを取り除きます。
大きな変頭筋脊椎動物標本からのCNS組織解剖には、解剖顕微鏡と二重突起プリック、鉗子、虹彩、スプリングハサミを使用して各CNS組織から髄膜を取り除き、脳室から脈絡叢の断片を取り除くように注意してください。収穫されたCNS組織の均質化のために、各CNS領域を個々のペトリ皿内の1〜2ミリメートルの部分にミンチする。小さな脊椎動物の標本からCNS組織を均質化するには、トランスファーピペットを使用して、1ミリリットルのMV-1溶液を添加して、ひき肉組織を懸濁させる。
その後、同じトランスファーピペットを使用して、皮質、小脳、脳幹、眼用ローブ、脊髄片を個々の10ミリリットルガラス組織グラインダーに分配し、PTFE害虫と5ミリリットルのMV-1溶液を使用して各組織を約10ストローク粉砕します。各組織スラリーを氷上の個々の15ミリリットルの円錐管に移し、鉗子を使用して視床下部と下垂体を100マイクロリットルのMV-1溶液に入れ、個々の1.7ミリリットルのチューブに入れる。次に、各組織をガラスマイクロペステスルで慎重に均質化する。
大きな脊椎動物の標本を均質化するには、斜め切り移管ピペットを使用して、55ミリリットルのガラス組織グラインダーに切り身組織を移し、グラインダーをオーバーヘッドスターラーに取り付けます。表に示すように均質化されている特定のCNS部分に従ってMV-1溶液の推奨量の半分を追加し、オーバーヘッドスターラーを毎分約150回転にします。ガラス管を慎重に上下に約30秒間動かしてから、オーバーヘッドスターラーをオフにして、均質化のためにMV-1溶液を追加し、均質なスラリーが得られるまで追加します。
次に、均質化した組織を氷上の50ミリリットルの円錐管に移す。マイクロ容器精製のために、ペレットは、遠心分離によってCNS組織を均質化し、上清を廃棄する。小さな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、ピペット皮質、小脳、脳幹、光学ローブおよび脊髄コードペレットは、サンプル当たり新鮮な氷冷MV-2溶液の5ミリリットルで、約10回、各チューブにさらに5ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加える。
慎重に混合するためにチューブを反転し、MV-2溶液の1ミリリットルで視床下部および下垂体ペレットを再中断します。大きな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、皮質、小脳、脳幹および脊髄のマイクロ容器のペレットに20ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加え、約5分間毎分40回転でチューブリボルバーのペレットを再中断する。再懸濁の終わりには、CNS組織のリカチを遠心分離で分離し、各チューブをゆっくりと回転させて上澄みを壁に沿って通過させ、液体界面の厚くて緻密なミエリン層をチューブ壁から慎重に取り外します。
ミエリンと液体のインターフェースを捨て、低糸状紙のワイプで包まれたヘラで各チューブの内側の壁をしみまきます。次に、ねじった低糸状紙ワイプを使用して余分な液体を吸収し、低結合チップを使用して各ペレットを1ミリリットルのMV-3溶液中で再懸濁させます。マイクロ容器溶出およびろ過の場合、新鮮なMV-3溶液を各CNS組織マイクロ容器スラリーに数ミリリットル混合し、凝集体を避けるために混合しながら、プルイットストレーナーを通して各懸濁液を個々の50ミリリットル円錐形チューブにひずむ。
CNS領域ごとに1つの変更されたフィルターホルダーに1つの20マイクロメートルナイロンネットフィルターを置きます。フィルターホルダーを50ミリリットルの円錐状チューブに移し、5ミリリットルの氷冷MV-3溶液でフィルターを濡らし、バッファーがフィルターホルダーを下に注ぎ、円錐形のチューブに入れます。溶出したマイクロ容器を各20マイクロメートルのナイロンネットフィルターに移し、5~10ミリリットルの氷冷MV-3溶液でマイクロ容器をすすきます。
鉗子を使用して、各フィルターを氷冷MV-3溶液を含む個々のビーカーに移し、各フィルターを約30秒間静かに振ってマイクロ容器を取り外します。15ミリリットル円錐形チューブに移管した後、遠心分離によってマイクロ容器を回収し、低結合ピペットを使用して、1ミリリットルの氷冷MV-3溶液中の各ペレットを再懸濁させます。次いで、小さな脊椎動物の標本からマイクロ容器の懸濁液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、20,000倍Gで5分間、摂氏4度で遠心分離を行う。
大型脊椎動物標本の場合は、懸濁液を個々の5ミリリットル遠心管に移し、4度で2,000倍Gで5分間遠心分離するためのMV-3溶液を4ミリリットル加えます。神経血管ユニットの固有成分は、示されているように、CD31、PDGFR-β、および皮質、小脳、下垂体、視床下部、脳幹、および脊髄マイクロ血管を含む4つのアクアポリンの免疫標識によって、示されるように単離されたマイクロ血管内で検出することができる。同様に、被着体結合タンパク質VE-カドヘリンの発現は、CLDN5及びゾヌラ・オクルデンス−1の緊密な接合タンパク質、三細胞結合タンパク質アングリン-1、及び基底マル・ケモカイン・リガンドCXCLモチーフ12、およびガンマグルタミルトランスビ転移酵素-1の発現を可視化することができる。
さらに、マイクロ血管の大部分はアルファ平滑筋アクチンの発現を欠いており、この分離プロトコルが選択的に小口径マイクロ血管を標的とすることを示している。鳥、うそつき、カエル、魚などの他の小さなリセンサイル脊椎動物から得られたマイクロ血管は、いくつかの形態学的特徴を共有し、この方法は、種間の神経血管単位の違いのさらなる特徴付けに有用であることを示唆している。タンパク質発現の変化を定量化すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎のピーク時に、脊髄マイクロ血管に沿った血管細胞接着分子1および結合接着分子Bの増加が明らかになる。
しかしながら、血管細胞接着分子1は下垂体の微細血管においても有意に増加し、視床下部および脳幹マイクロ血管において減少した。また、全てのCNS組織において慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎の際に血管細胞接着分子1発現、視床下部および下垂体マイクロ血管におけるB発現の接合接着分子に変化が見られる。ウェスタンブロット、PCR、免疫体化学などの定量分析を行い、この手順に従って血液脳関門内の遺伝子およびタンパク質発現パターンに関する洞察を明らかにすることができます。
パラホルムアルデヒドは、急性毒性試薬であり、適切なPPEを身に着けている間、常に煙のフードの下で処理する必要があります。
