Bu aynı anda ve verimli bir şekilde arındırmak ve embriyonik farelerden kültür birincil oküler ve spinal motor nöronlar için ilk protokoldür. Motor nöron hastalığının altında yatan mekanizmaların incelenmesini sağlar. Bu protokol mevcut sistemlere bir in vitro okülomotor kültür bileşeni ekler ve karşılaştırma için saf türler ve yaş eşleşen spinal motor nöron kültürleri sağlar.
Amiyotrofik lateral sklerozda spinal motor nöronlar dejenere olurken okülomotor nöronlar nispeten korunur. Bu kültürlerin karşılaştırılması hastalık mekanizması ve tedavisi hakkında bilgi verebilir. Bu yöntem motor nöron gelişimi, hastalık ve selektif kırılganlık altında yatan mekanizmaların çalışmalarını kolaylaştıracaktır.
Kültür sistemimiz motor nöron morfolojisi, moleküler biyoloji ve elektrofizyolojinin karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu teknikte yeni olanlar için çok fazla pratik yapmanızı öneririz. Diseksiyon teknik olarak zor olabilir ve birincil kültür için yeterli nöron elde etmek için birden fazla dissektör gerekli olabilir.
Döllenmeden yaklaşık 11,5 gün sonra hamile bir fareden Adacık1 EGF pozitif embriyolar alarak başlayın. Sprey iyice etanol ile karın ve steril mikrodiseksiyon makas ve başparmak pansuman forceps ile rahim kaldırmak. Kısaca steril PBS rahim yıkayın.
Daha sonra önceden soğutulmuş steril PBS ile dolu diseksiyonu plakasına aktarın. Mikroskobun parlak ışığı altında, mikrodiseksiyon makas, başparmak giydirme forceps ve Dumont 5 cımbız kullanarak dikkatle rahim embriyoları çıkarın. Sonra steril bir Moria mini delikli kaşık önceden soğutulmuş hazırda bekletme E düşük floresan orta 1X V27 ile desteklenen dolu 24-well plaka ayrı bir kuyuya her embriyo aktarmak için kullanın.
Plakayı buzda tutarken, bir embriyoyu steril bir diseksiyon plakasına aktarın ve tamamen buz gibi steril Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile kaplayın. Orta beyne zarar vermeden embriyonun yüzünü ve kuyruğunu çıkarmak için cımbız kullanın. Daha sonra embriyoyu, mikroskobun ön ünü işaret eden uzuvlar ve kuyruklarla yatkın bir şekilde yerleştirin.
Küçük bir açıklık oluşturmak için dördüncü ventrikül çatı sını kesmek için cımbız kullanın. Dördüncü ventrikül ve çatı arasında oluşturulan alana cımbız kanca için bu açıklığı kullanın. Kortekse ve lateral zemin plaka ve motor kolon embriyo rostral dorsal yüzeyi boyunca diseksiyon.
Daha sonra GFP pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini ortaya çıkarmak için incelenmiş dokuyu açık bir kitap şeklinde açın. Ventral orta beyni embriyodan dikkatlice ayırın ve cımbız ve mikrodiseskes bıçağı yla meningeal dokuyu çıkarın. İki taraflı GFP pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini zemin plakasından ve diğer GFP pozitif çevre dokulardan ayırın ve nöronlara dokunmaktan veya zarar vermemeye özen talın.
Ayrı CN3 ve CN4 çekirdekleri topluyorsanız, bu iki çekirdeğin orta beyin boyunca kesilmiş ve minimal HBSS ile diseksiyonlu ventral orta beyin dokusu toplamak için bir P1000 pipet kullanın. Diseksiyon ortamı ile doldurulmuş etiketli 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpü parçalanmaya kadar buzüzerinde saklayın. Toplam sayı deneysel gereksinimleri karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral orta beyinleri çekmeye devam edin.
Ventral omuriliği incelemek için, embriyoyu mikroskobun ön yüzüne bakacak şekilde eğilimli tutun. Cımbız bir çift ile tutun ve dördüncü ventrikül açılmamış kaudal kısmına diğer çiftin ucunu takın. Embriyonun tüm rostrokaudal ölçüde arka beyin ve omurilik dorsally geri kalanını açın.
Dördüncü ventrikül başlayan ve makas olarak forseps kullanarak kaudal omuriliğin merkezi kanal doğru çalışan dorsal doku kesin. Sonra cımbız bir set ile embriyo tutun ve diğer çifti ile her iki tarafta dorsal doku flep kapalı çimdik. Her iki tarafta testere benzeri hareketlerle ventral omuriliği kaldırarak GFP pozitif SMN'nin hemen altına delmek için mikrodiseskes bıçağını kullanarak ventral omuriliği çıkarın.
Alt ekstremitenin üst sınırında omuriliği enine kes ve servikal lomber kısmını çıkarın. İlk GFP pozitif ön boynuz projelerinin yer aldığı C1'in üzerinde enine doğrudan kesin. Ventral omurilik dorsal tarafını yukarı yerleştirin ve gfp pozitif SMN sütunları arasında gfp negatif dokuya bir çift cımbız la basarak tutun.
Mikrodiseskes bıçağı ile GFP pozitif SMN sütunun her iki tarafını keserek kalan ekli mezenkim, DRG'leri ve dorsal omuriliği çıkarın. En az HBSS ile diseksiyonventral omurilik dokusu toplamak ve diseksiyon ortamı ile dolu etiketli 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp yerleştirmek için bir P1000 pipet kullanın. Dissociation kadar buz üzerinde saklayın ve aynı tüp içinde ek embriyolardan ventral omurilik çekerek devam edin.
Diseksiyon doku örnekleri ile mikrosantrifüj tüplerin her birine uygun miktarda papain çözeltisi ekleyin. Tüpleri 37 derecede 30 dakika boyunca parmak la çalarak her 10 dakikada bir tüplerini çalkalayın. Kuluçkadan sonra, her süspansiyonu sekiz kez P200 pipetle triturate ve santrifüj edin, 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin.
Hücre peletlerini uygun albumin ovomucoid inhibitör çözeltisi hacmi ile hafifçe yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın. Santrifüjleri tekrarlayın. Sonra dikkatle bir P1000 pipet ile supernatant çıkarın.
Diseksiyon ortamının uygun hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın. Süspansiyonları 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Ardından, CN3/CN4 ve SMN'den alınan GFP pozitif hücrelerini yalıtmak için FACS sıralamasını kullanın.
Motor nöron kültürü ortamı ile izole hücre süspansiyonları seyreltmek uygun yoğunlukları için 37 derece santigrat önceden ısıtılır ve bir PDL laminin kaplı 96-iyi plaka bir kuyuya süspansiyon 200 mikrolitre ekleyin. Kültür 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit inkübatör motor nöron kültür ortamı her beş günde bir yenilemek için emin nöronlar. Başarılı bir şekilde izole edilen nöronlar kültürde yetiştirildiğinde, neredeyse saf primer CN3/CN4 ve SMN kültürleri elde edildi ve 14 gün boyunca in vitro olarak sürdürüldü.
Motor nöron belirteci Islet1 ve nöronal marker TUJ1 ile immünositokimya ile değerlendirildiğinde cn3/CN4 için %93.5, SMN için %86.7 idi. Saflıklar büyük ölçüde embriyoların yaşına ve FACS sırasında GFP kapıları için uygun eşiklerin belirlenmesine dayanıyordu. E10.5 embriyolarından izole edilen nöronların saflığı E11.5 embriyolarınınkilerle karşılaştırılabilir.
Ancak E13.5 embriyoları kullanıldığında saflık önemli ölçüde azalmıştır. Primer CN3/CN4'lerin ve SMN'lerin endoplazmik retikulum streslerine farklı yanıtlar gösterilip gösterilemedik lerini belirlemek için hücreler iki gün in vitro olarak değişen siklopiazonik asit veya CPA konsantrasyonları ile tedavi edildi ve üç gün sonra immünositokimyanın sağkalım oranlarını değerlendirmesi için sabitlendi. Her örnekteki canlı nöronların sayısı sayıldı ve sağkalım oranları hesaplandı.
CN3/CN4 monokültürleri SMN monokültürlerine göre EBM tedavisine göre anlamlı olarak daha dirençliydi. Bu prosedürü takiben, motor nöronları incelemek için birçok ek yöntem yapılabilir. Birkaç örnek elektrofizyoloji, hücre biyolojisi, transkripsiyon veya kromatin erişilebilirlik çalışmaları içerir.
