Dies ist das erste Protokoll, das gleichzeitig und effizient primäre okuläre und spinale motorische Neuronen von embryonalen Mäusen reinigt und kultiviert. Es ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die der motorischen Neuronenerkrankung zugrunde liegen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Systemen eine neuartige in-vitro-Okulomotorik-Kulturkomponente hinzu und bietet reine Arten und altersgerechte Wirbelsäulen-Neuronenkulturen zum Vergleich.
Bei der amyotrophen Lateralsklerose degenerieren die spinalen motorischen Neuronen, während okulomotorische Neuronen relativ verschont bleiben. Der Vergleich dieser Kulturen könnte Einblicke in Krankheitsmechanismus und Therapie geben. Diese Methode wird Studien über die Mechanismen, die der Entwicklung des motors Neuronen, Krankheit und selektiver Anfälligkeit zugrunde liegen, erleichtern.
Unser Kultursystem ermöglicht die Charakterisierung der motorischen Neuronenmorphologie, Molekularbiologie und Elektrophysiologie. Für diejenigen, die neu in dieser Technik, empfehlen wir viel Übung. Die Zerlegung kann technisch anspruchsvoll sein und mehrere Dissektoren können erforderlich sein, um ausreichende Neuronen für die Primärkultur zu erhalten.
Beginnen Sie mit der Ernte Islet1 EGF positive Embryonen von einer schwangeren Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung. Den Bauch gründlich mit Ethanol besprühen und die Gebärmutter mit einer sterilen Mikrodissektionsschere und Daumenverbandszange entfernen. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in sterilem PBS.
Dann auf die mit vorgekühlten sterilen PBS gefüllte Sezierplatte geben. Entfernen Sie unter dem hellen Licht des Mikroskops vorsichtig die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Mikrodissektionsschere, Daumen-Dressing-Zangen und Einer Pinzette von Dumont 5. Verwenden Sie dann einen sterilen Moria Mini perforierten Löffel, um jeden Embryo in einen separaten Brunnen einer 24-Well-Platte zu übertragen, die mit einem vorgekühlten Hiberat E Low Fluoreszenzmedium gefüllt ist, ergänzt mit 1X V27.
Während Sie die Platte auf Eis halten, übertragen Sie einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte und bedecken Sie ihn vollständig mit eiskalt steriler Hank es Balanced Salt Solution oder HBSS. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gesicht des Embryos und des Schwanzes zu entfernen, ohne das Mittelhirn zu beschädigen. Dann stellen Sie den Embryo anfällig mit Gliedmaßen gespannt und Schwanz zeigt nach vorne des Mikroskops.
Verwenden Sie eine Pinzette, um das Dach des vierten Ventrikels aufzuschlitzen, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Verwenden Sie diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Sezieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryorostrals zum Kortex und seitlich zur Bodenplatte und Motorsäule.
Öffnen Sie dann das sezierte Gewebe in einer offenen Buchweise, um die GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne zu enthüllen. Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie Meningealgewebe mit einer Pinzette und einem Mikrodissektionsmesser. Sezieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne von der Bodenplatte und anderen GFP-positiven umgebenden Geweben entfernt, wobei darauf geachtet wird, dass die Neuronen nicht berührt oder beschädigt werden.
Wenn Sie separate CN3- und CN4-Kerne sammeln, schneiden Sie entlang des Mittelhirns dieser beiden Kerne und verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das sezierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS zu sammeln. Legen Sie es in ein beschriftetes 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium gefüllt und lagern Sie das Rohr auf Eis bis zur Dissoziation. Ziehen Sie weiterhin ventrale Mittelhirne aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre, bis die Gesamtzahl den experimentellen Anforderungen entspricht.
Um das ventrale Rückenmark zu sezieren, halten Sie den Embryo anfällig mit dem Kopf nach vorne des Mikroskops. Halten Sie es mit einer Pinzette und legen Sie die Spitze des anderen Paares in den ungeöffneten kaudalen Teil der vierten Herzkammer. Öffnen Sie den Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos.
Schneiden Sie das Rückengewebe ab dem vierten Ventrikel und arbeiten in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks mit der Zange als Schere. Halten Sie dann den Embryo mit einer Pinzette und kneifen Sie die Klappe des Rückengewebes auf jeder Seite mit dem anderen Paar. Entfernen Sie das ventrale Rückenmark, indem Sie das Mikrodissektionsmesser verwenden, um direkt unterhalb des GFP-positiven SMN zu durchbohren, indem Sie das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten anheben.
Schneiden Sie das Rückenmark quer an der oberen Grenze der unteren Extremität und entfernen Sie den Zervixlenteil. Schneiden Sie quer direkt über C1, wo das erste GFP-positive Vorderhorn projiziert wird. Legen Sie das ventrale Rückenmark dorsale Seite nach oben und halten Sie es durch Drücken des GFP-negativen Gewebes zwischen den GFP-positiven SMN-Säulen mit einer Pinzette.
Entfernen Sie das verbleibende angebrachte Mesenchym, DRGs und rückendes Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser beschneiden. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das sezierte ventrale Rückenmarkgewebe mit minimalem HBSS zu sammeln und in ein beschriftetes 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium zu legen. Lagern Sie es auf Eis bis zur Dissoziation und ziehen Sie weiterhin ventrale Rückenmark von zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre.
Fügen Sie jedem der Mikrozentrifugenröhrchen mit den sezierten Gewebeproben das entsprechende Volumen der Papainlösung hinzu. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, indem Sie die Rohre alle 10 Minuten durch Fingerstreicher aufwirbeln. Nach der Inkubation jede Suspension achtmal mit einer P200 Pipette sanft trituieren und bei 300 mal g fünf Minuten zentrifugieren.
Setzen Sie die Zellpellets mit der entsprechenden Menge an Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten pipetieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Dann entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000 Pipette.
Setzen Sie die Zellen im entsprechenden Volumen des Seziermediums wieder aus. Filtern Sie die Suspensionen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb. Verwenden Sie als Nächstes die FACS-Sortierung, um GFP-positive Zellen zu isolieren, die von CN3/CN4 und SMN seziert wurden.
Verdünnen Sie die isolierten Zellsuspensionen mit motorischem Neuronenkulturmedium auf 37 Grad Celsius auf die entsprechende Dichte vorgewärmt und fügen Sie 200 Mikroliter der Suspension zu einem Brunnen einer PDL Laminin-beschichteten 96-Well-Platte hinzu. Kultur die Neuronen in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator sicherstellen, dass die motorische Neuronenkultur Medium alle fünf Tage zu erfrischen. Wenn erfolgreich isolierte Neuronen in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine primäre CN3/CN4- und SMN-Kulturen erhalten und 14 Tage lang in vitro gepflegt.
Die Reinheit der Kulturen an zwei Tagen in vitro betrug 93,5% für CN3/CN4 und 86,7% für SMN, wenn sie von der Immunzytochemie mit dem motorischen Neuronenmarker Islet1 und dem neuronalen Marker TUJ1 beurteilt wurden. Die Reinheit beruhte stark auf dem Alter der Embryonen und der Festlegung der entsprechenden Schwellenwerte für GFP-Tore während der FACS. Die Reinheit der aus E10.5-Embryonen isolierten Neuronen war mit denen von E11.5-Embryonen vergleichbar.
Die Reinheit nahm jedoch signifikant ab, als E13.5-Embryonen verwendet wurden. Um festzustellen, ob primäre CN3/CN4s und SMNs unterschiedliche Reaktionen auf endoplasmatische Retikulum-Stressoren zeigten, wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cyclopiazonsäure oder CPA an zwei Tagen in vitro behandelt und drei Tage später für die Immunzytochemie zur Bewertung der Überlebensverhältnisse fixiert. Die Anzahl der lebensfähigen Neuronen in jeder Probe wurde gezählt und das Überlebensverhältnis berechnet.
CN3/CN4-Monokulturen waren deutlich resistenter gegen CPA-Behandlungen als SMN-Monokulturen. Nach diesem Verfahren können viele zusätzliche Methoden durchgeführt werden, um motorische Neuronen zu untersuchen. Einige Beispiele sind Studien zur Elektrophysiologie, Zellbiologie, Transkription oder Chromatin-Zugänglichkeit.
