이것은 배아 마우스에서 1 차적인 안구 및 척추 운동 신경을 동시에 능동하게 정화하고 배양하는 첫번째 프로토콜입니다. 그것은 모터 뉴런 질병의 근본적인 기계장치의 연구를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 기존 시스템에 새로운 체외 운동 배양 성분을 추가하고 비교를 위해 순수한 종과 나이 일치 척추 운동 신경 문화를 제공합니다.
근위축성 측삭 경화증에서는 척추 운동 뉴런이 퇴화하면서 오큘로운동 뉴런은 상대적으로 절약됩니다. 이 문화를 비교하는 것은 질병 기계장치 및 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 이 방법은 모터 뉴런 개발, 질병 및 선택적 취약성의 근본적인 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 합니다.
우리의 배양 시스템은 운동 신경 형태학, 분자 생물학 및 전기 생리학의 특성화를 가능하게 합니다. 이 기술에 새로운 사람들을 위해, 우리는 연습을 많이 하는 것이 좋습니다. 해부는 기술적으로 도전적일 수 있고 다중 해장은 1 차 적인 문화에 대한 충분한 뉴런을 얻기 위하여 필요할 수 있습니다.
임신 한 마우스에서 Islet1 EGF 양성 배아를 수확하여 시작 약 11.5 일 후 수정. 에탄올로 복부를 철저히 뿌리고 멸균 미세 절 가위와 엄지 손가락 드레싱 집게로 자궁을 제거하십시오. 멸균 PBS에서 자궁을 간략하게 씻으시다.
그런 다음 미리 냉각 된 멸균 PBS로 채워진 해부 플레이트로 옮춥니다. 현미경의 밝은 빛 아래, 조심스럽게 미세 절 가위, 엄지 드레싱 집게, 듀몬트 5 핀셋을 사용하여 자궁에서 배아를 제거합니다. 그런 다음 멸균 된 모리아 미니 천포 숟가락을 사용하여 각 배아를 1X V27로 보충 된 미리 차가운 최대 절전 모드 E 저형 광채 매체로 채워진 24 웰 플레이트의 별도의 우물로 옮기는 것입니다.
접시를 얼음 위에 유지하면서 한 배아를 멸균 해부 판으로 옮기고 얼음 냉기 멸균 행크의 균형 잡힌 소금 용액 또는 HBS로 완전히 덮습니다. 핀셋을 사용하여 중간 뇌를 손상시키지 않고 배아와 꼬리의 얼굴을 제거하십시오. 그런 다음 사지가 걸려 있고 꼬리가 현미경의 전면을 가리키는 경향이있는 배아를 놓습니다.
핀셋을 사용하여 작은 개구부를 생성하기 위해 네 번째 심실의 지붕을 열어 슬릿하십시오. 이 개구부를 사용하여 핀셋을 네 번째 심실과 지붕 사이에 생성된 공간에 연결합니다. 배아 의 등대 표면을 따라 피질과 측면으로 바닥 판과 모터 컬럼으로 해부한다.
그런 다음 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 드러내기 위해 공개 된 책 방식으로 해부 된 조직을 엽니 다. 복부 중뇌를 배아에서 조심스럽게 분리하고 핀셋과 미세 절 칼로 수막 조직을 제거합니다. 양측 GFP 양성 CN3 및 CN4 핵을 바닥 판과 다른 GFP 양성 주변 조직에서 멀리 해부하여 뉴런을 만지거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.
별도의 CN3 및 CN4 핵을 수집하는 경우, 이 두 핵의 중뇌를 따라 잘라 최소한의 HBSS와 해부 된 복부 중뇌 조직을 수집하는 P1000 파이펫을 사용합니다. 해부 매체로 채워진 1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 놓고 해실 매체가 될 때까지 튜브를 얼음에 보관하십시오. 총 수가 실험 요구 사항을 충족 할 때까지 동일한 튜브의 추가 배아에서 복부 중뇌를 계속 당깁니다.
복부 척수를 해부하려면 머리가 현미경의 전면을 향하도록 배아를 수시합니다. 핀셋 한 켤레로 잡고 다른 쌍의 끝을 네 번째 심실의 미개봉 된 caudal 부분에 삽입합니다. 배아의 전체 로스트로코달 정도에 뒤뜰과 척수의 나머지 부분을 번들로 엽니다.
제 4 심실에서 시작하여 집게를 가위로 사용하여 척수의 중앙 운하를 향해 작업하는 등간 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 한 세트의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 쌍으로 양쪽에 등쪽 조직의 플랩을 꼬집습니다. 마이크로 디스섹션 나이프를 사용하여 복부 척수를 제거하여 GFP 양성 SMN 바로 아래를 관통하여 양쪽에 톱질 같은 움직임으로 복부 척수를 들어 올리십시오.
하반신의 상반신에서 척수를 횡적으로 자르고 자궁 경부 요추 부분을 제거합니다. 첫 번째 GFP 양성 전방 경적 프로젝트가 있는 C1 바로 위를 가로막고 자른다. 복부 척수 등쪽을 위로 놓고 GFP 양성 SMN 컬럼 사이에 핀셋을 눌러 고정합니다.
마이크로 디스섹션 칼로 GFP 양성 SMN 컬럼의 양면을 다듬어 남은 부착된 메센키메, DRGs 및 등쪽 척수를 제거합니다. P1000 파이펫을 사용하여 최소한의 HBSS로 해부된 복부 척수 조직을 수집하고 해부 배지로 채워진 1.7 밀리리터 미세 센실리후지 튜브에 배치하십시오. 해리될 때까지 얼음 위에 보관하고 동일한 튜브에 있는 추가 배아에서 복부 척수를 계속 당깁니다.
해부된 조직 샘플로 각 미세 원심 분리관에 적절한 양의 파아항 용액을 추가합니다. 37°C의 튜브를 30분간 배양하여 손가락으로 10분마다 튜브를 교반합니다. 인큐베이션 후 P200 파이펫으로 각 서스펜션을 8회 부드럽게 세리라세이션하고 원심분리기를 5분 동안 300배 g로 세리세티합니다.
알부민 난소쿠푸이드 억제제 용액의 적절한 부피로 세포 펠릿을 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재보냅니다. 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 P1000 파이펫으로 상체를 조심스럽게 제거합니다.
해부 배지의 적절한 부피에서 세포를 다시 중단합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 다음으로, FACS 정렬을 사용하여 CN3/CN4 및 SMN에서 해부된 GFP 양성 세포를 분리합니다.
운동 신경 배양 배지로 격리 된 세포 현탁액을 적절한 밀도에 섭씨 37도로 미리 데워진 것으로 희석하고 PDL 라미닌 코팅 96 웰 플레이트의 우물에 200 마이크로리터를 첨가하십시오. 37도 의 섭씨 및 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 뉴런을 배양하여 5 일마다 운동 신경 배양 배지를 새로 고치십시오. 성공적으로 고립 된 뉴런이 문화에서 성장했을 때, 거의 순수한 1 차 CN3/CN4 및 SMN 배양은 시험관내에서 14 일 동안 얻어지고 유지되었습니다.
시험관 내 이틀 동안 배양의 순수성은 CN3/CN4에 대한 93.5%, SMN의 경우 86.7%로 운동 신경 마커 Islet1 및 뉴런 마커 TUJ1을 통한 면역세포화학에 의해 평가되었다. 순수성은 배아의 나이와 FACS 도중 GFP 게이트에 대한 적절한 임계값을 설정하는 데 크게 의존했습니다. E10.5 배아에서 분리된 뉴런의 순도는 E11.5 배아의 것과 비슷했습니다.
그러나, 순도는 E13.5 배아를 사용했을 때 현저하게 감소하였다. 1차 CN3/CN4s 및 중소기업이 내민성 망상 스트레스에 대한 차동 반응을 보였는지 여부를 결정하기 위해, 세포는 체외에서 2일 간 사이클로피아존산 또는 CPA의 다양한 농도로 처리되었고 생존비율을 평가하기 위해 면역세포화학을 위해 3일 후에 고정하였다. 각 샘플에서 실행 가능한 뉴런의 수가 계산되고 생존비가 계산되었다.
CN3/CN4 단배양은 SMN 단배문화에 비해 CPA 치료에 훨씬 더 저항했다. 이 절차에 따라, 많은 추가 방법은 모터 뉴런을 검사하기 위해 수행 될 수있다. 몇몇 보기는 전기 생리학, 세포 생물학, 전사, 또는 크로마티닌 접근성의 연구 결과를 포함합니다.
