私たちは、優れた技術サポートのためにサンドラBar​​genに感謝。この作品は、タンパク質の研究部門（PRD、TP A1.2（RCおよびTS）、およびRUB研究フォンド、Rektoratsprogrammeによってサポートされていました - 。wissenschaftlicher Nachwuchs（AK）モノクローナル抗体は39.4D5とF55A10発達研究ハイブリドーマから得られた銀行（DSHB、アイオワシティ、アイオワ州）。

特殊な試薬の場合：タブを参照してください。 1。記載されているその他すべての試薬はシグマアルドリッチから得られた細胞培養グレードの品質にあります。 1。料理/カバースリップのPORN-H/lamininコーティング<ol><li> 150mMのホウ酸緩衝液pH 8.35で0.5 mg / mlのポリ- DL -オルニチン臭化水素酸塩（PORN - H）のワーキング溶液を調製します。 <ol><li> 50mgのポルノ/ 1mlのホウ酸緩衝液の原液は事前に準備し、-20℃で保存することができます</li></ol></li><li> 100％エタノールで炎でガラスカバースリップを滅菌し、空気乾燥してみましょう。 </li><li>一晩4十分なPORN - Hソリューション℃の表面を覆う</li><li>翌日に滅菌水と空気乾燥カバーグラスで3回洗浄する。 </li><li> HBSSで2.5μg/ mlのラミニンのワーキング溶液を調製<ol><li>アリコートを-20℃で保存することができます° C使用直前に4で解凍。 </li></ol></li><li>ラミニン溶液によるPORN - H -コーティングされたカバースリップの表面をカバーし、それらを使用するまで室温で少なくとも2時間インキュベートすることができます。 </li></ol> 2。精製プレートのレクチンコーティング<ol><li>滅菌水に10 mMトリス、pH 9.5の溶液を調製します。 </li><li> 10μg/ mlの終濃度にレクチンを（HBSSでレクチン（シグマL9640）粉を解決する）を追加します。 </li><li>コー​​トは、レクチン溶液8mlを持つ10cmの細胞培養皿の表面と、それが室温で少なくとも30分間インキュベートてみましょう。 </li><li> HBSS、使用するまでHBSS中の店でプレートを3回洗浄する。 </li><li> 30mMのKClを、0.8％（w / v）の塩化ナトリウムを脱分極-溶液を調製します。室温（RT）でろ過し、店舗によって滅菌する。 </li></ol> 3。運動ニューロン培養培地<ol><li>融解のウマ血清一晩4℃、55℃で失活℃で30分間、-20 5ml及び店舗に分注し℃に室温で使用する前に直接アリコートを解凍。 </li><li>ストア-20℃で1ミリリットルaliqoutsでB27 -サプリメント使用直前に室温でB27のサプリメントを解凍。凍結と融解を避けてください。 </li><li>アリコート-20℃で0.5 mlのアリコートとストアへのグルタミンとは1:100で、それを使用してください。 </li><li> 0.1％BSAと滅菌水で10μg/ mlのCNTFのストック溶液を調製。 -20℃で保存</li><li> 2.5ミリリットルウマ血清1mlのB27 -サプリメントとは直接使用前に0.5ミリリットルグルタミンと46ミリリットルneurobasalメディアを混在させること。 </li><li> 37℃に10 ng / mlの培地とプレ暖かい培地の最終濃度にCNTF追加</li></ol> 4。脊髄の解剖<ol><li> E12.5妊娠マウスを犠牲にし、慎重に胚を削除します。完全に胚をカバーするのに十分なRT HBSSを追加。 </li><li>頭部と尾部を取り外し、またがって手足と胚の背側を上に置きます。 </li><li> one鉗子で胚を固定し、他の鉗子と外側の皮を取り除く。 </li><li>その下に鉗子を刺すことによって脊髄を取り出して、脊髄の両側にのこぎりのような動きでそれを持ち上げます。 </li><li> HBSSで新しい皿に分離された脊髄を転送し、背側の脊髄の中心的なチャネルを開きます。 </li><li>脊髄を囲む髄膜を除去することによって、後根神経節を削除します。 </li><li>準備が完了するまで氷上で1 mlのHBSSとストアでいっぱいエッペンドルフ反応管のレクチンプレート当たり6胚までの脊髄の腰の部分を集める。 </li></ol> 5。レクチンベースの精製により、運動ニューロンの濃縮注：ここに最新の、次の手順を開始する前に培地を調製し、prewarm（ステップ3を参照。） <ol><li> 4℃-20℃と融解℃で保存、100mlのHBSSで1グラムトリプシンを解くことによってトリプシン溶液を調製します</li><li>ミックス1グラム98ミリリットルのHBSSと1 M HEPES pH7.4の液2mlとトリプシンインヒビターは、1mlのアリコートを4℃で保存してください。 </li><li>細胞培養フードに脊髄にチューブを移し、慎重にHBSS 700μlを削除します。 </li><li> 7.5μlのトリプシン溶液と慎重にチューブを転倒混和する。 </li><li> 37℃で8分間trypsinationを実行℃に</li><li> 30μlのトリプシンインヒビターを加えることによって反応を停止し、それ以上の細胞の集合体が見えるようになるまで1000μlのピペットの先端で慎重に10から15回までピペッティングし、ダウン（粉薬）。 20〜200μlをピペットと対応するチップで粉砕を繰り返します。 </li><li> HBSSで満たされたレクチンプレートに細胞溶液をピペットでゆっくりと板を回転させることによって細胞を分散させる。 </li><li>振動のない表面上に室温で60分間レクチンプレートを保管してください。汚染を避けるために、それをカバーしています。 </li><li>非常に穏やかにHBSSを削除し、細胞断片および接続/未接続のないセルを削除するには、予め温めておいたHBSSでプレートを慎重に4回洗浄する。 </li><li>すぐに最後の洗浄ステップの後、プレートに500μlの脱分極のソリューションを追加し、それが1分インキュベートてみましょう。 </li><li>振って、レクチン結合細胞の剥離を促進し、プレートをタッピング。 </li><li> 2ミリリットル予め温めておいた培地及び15 mlファルコンチューブに移すとプレートを埋める。 </li><li>ノイバウアー計数チャンバーで細胞の数を数えます。 </li><li>プレートアプリケーションに応じて、適切な数のラミニンコートしたカバースリップまたはプレート上に細胞。 </li><li> 1日目と、古い培地の50％を慎重に交換してその後隔日で培地交換を行います。予め温めておいた、作りたての新しい培養液を常に使用します。 </li></ol> 6。代表的な結果： 胚の運動ニューロンはE12にE14でのマウスの胚から得ることができる。腰部脊髄の総細胞集団の2-3％は、運動ニューロンで構成され、後根神経節の神経細胞が同様にNTR陽性P75であるとして、それは（レクチンベースpreplatingの手順を開始する前に、これらの細胞を取り除くことが重要です。概要については図1と図2を参照）。第二に、髄膜は、それらが適切にレクチンベースpreplatingの手順（図2および図3）で除去することはできないとして、同様に除外されるべき強く分裂細胞が含まれています。さらに悪いケースでは、これらの細胞は培養プレートを生い茂るできます。図3B及び3Dの代表的な写真も（プロトコールのステップ5.9を参照）が実行されている手順を洗浄後に低細胞密度についての印象を与える。胎児マウスの運動ニューロンの培養は、通常最大5または7日間維持されています。この期間中に細胞が最大長（図4）に彼らの神経突起を確立する。神経突起の長さが強くプレート8上の基板に依存する。典型的な基質は、ポルノ- H覆われた培養皿上に被覆されたラミニンです。運動ニューロンは、また、水の溶解8で生成される細胞外マトリックスのように、他の以下の定義された基板上に出成長することができます。次善のコーティングのケースでは、神経突起の長さと成長円錐の面積が減少し、細胞死は通常、増加している。栄養サポートは、培養中のマウス胎児の運動ニューロンの生存に重要な役割を果たしている。栄養サポート6なしの10％から20％へ7日目ドロップで最初に播種した細胞の生存。脳由来神経栄養因子（BDNF）と毛様体神経栄養因子（CNTF）は、最も一般的に使用される要因ですが、他はよく[白血病阻害因子（LIF）、Cardiotrophin - 1（CT - 1）、塩基性線維芽細胞成長因子は、（bFGFのように生存を促進することができる）、インスリン様成長因子1（IGF - 1）9]。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> 胎児マウスの運動ニューロンの準備のための図1。フロースキーム。回路図の描画は、マウス胚の運動ニューロンの単離および培養のためのさまざまな手順を示しています。略語：SC：脊髄、HBSS：ハンクス平衡塩溶液、MN：運動ニューロン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> 図2 E12.5マウスから脊髄の腰部分の分離：。。E12.5マウス胚。次のステップのために、頭部と尾部を除去し、本体は背アップ位置Bに配置されます：背アップの位置に胚。脊髄の左右にあるピンセットは、その位置での胚の体を固定している。鉗子の一つは、その後、その位置に胚を固定するために使用されるスキンをカットすると、脊髄の下に他をカットするために使用されるC：。E12.5マウス胚から隔離された脊髄は。脊髄（腰椎、胸椎、頚椎）の部分が示されている。脊髄は、髄膜および後根神経節の一部はまだそれらにアタッチするに囲まれているDが：。脊髄は、長手方向に中心管に向かってそれを開くために背側にカットされ、E：。腹側の髄膜が今では平坦化された脊髄から分離してください。注：オフ撮影中に、腰の部分が小さなカットによってマークされているFが：。脊髄の腰の部分だけを、さらに手続きのために取られる。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> 図3決定及びE12.5マウス胚の腰部脊髄からの膵島陽性細胞の分離：。。膵島- 1 / 2抗体の胚の腰部脊髄内のラベル運動ニューロンの列（赤、矢印）およびヘキスト社のラベルのすべてセクション内の核。 E12.5 lumar脊髄の断面。 E12.5マウス胚では、標準的な手順によれば、6時間の4％パラホルムアルデヒド中で浸固定リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、ショ糖で処理した。 20μmの凍結切片をクリオスタットで採取し、切片は標準的な手順11に従ってimmunhistochemical染色のために処理されていました。その後、細胞核の局在化のためにヘキストで標識されたセクションのウェア。なお、後根神経節ニューロンだけでなく、準備の手順は、単離手順からこの組織の部分が除外されるというIslet-1/2-positiveですB：。膵島- 1 / 2とラベル付けされたが（赤、矢印）E12から解離した腰部脊髄細胞。 5胚、左 - 前と右 - レクチンベースpreplating後。細胞はすべての細胞核を可視化するヘキストで対比染色したC：。レクチンベースpreplating前後Islet-1/2-positive細胞の定量D：E12.5胚からNkx6.1ラベル付け運動ニューロン培養で1日後。細胞はすべての核をcisualiezeにヘキストで対比染色した。すべての細胞の90％はNkx6.1陽性であることに注意してください。略語：SC：脊髄、MN：運動ニューロン、DRG：後根神経節。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> 図4 E12.5マウスの運動ニューロンの特徴づけとB：。。エンリッチは腰部脊髄運動ニューロンが in vitro で 0日（0div）にし 、in vitro（2div） の 2日目のP75 NTRを表現E12.5マウスを単離した。細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて標準的な手順にしたがってp75のNTRのために染色した。細胞はすべての核を可視化するヘキストを用いて対比染色したCが：。エンリッチの運動ニューロンをPORN - Hとラミニン上でin vitroで 5日間（5div）後の培養基質として、β- III -チューブリンのためのCNTFのステンドグラスの存在下で行われる。細胞は長い神経突起を成長していることに注意してくださいと長い方（分岐）プロセスと1つ以上の短いプロセス（軸索と樹状突起）で典型的な運動ニューロンの形態が表示されます。略語：MN：運動ニューロン、DIV：in vitroでの日。 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> レクチンベースpreplatingなし解離後 </td></tr><tr><td> 細胞/ SCの合計数 </td><td> トリパンブルー陽性細胞[％] </td><td> Islet-1/2-陽性細胞[％] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> 平均 ± SDを</td><td> 1.021.0 ± 147.1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> レクチンベースpreplating付き </td></tr><tr><td> preplating / SC後の細胞の数 </td><td> トリパンブルー陽性細胞[％] </td><td> Islet-1/2-陽性細胞[％] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> 平均 ± SDを</td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 表1。特にこの目的のために3種類の分離法から段階E12.5から、マウス胚の運動ニューロンの代表的な分離手順の要約。結果は、合計数値またはパーセンテージの数値± SDとして与えられる。略称：SC：脊髄、SD：標準偏差。 <table border="1"><tbody><tr><td> p75のパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 </td><td> レクチンベースのパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 表2。レクチンベースおよびp75 - 1から始まるパン運動ニューロンの細胞数の比較。結果はパーセンテージの数値± SDとして与えられる。

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレクチンベースpreplating手法の利点は、P75 NTRベースのパンの手順よりも安価であることである、とレクチンは抗体よりも安定しています。図に示されている濃縮。 2とタブ。手順は、細胞のこれらの細胞の大部分が運動ニューロンのマーカー膵島- 1 / 2を発現していることを同じような数字の精製を可能にすることが図1に示す。最も重要なステップは、腰部脊髄の分離手順です。髄膜とDRGS（図2）を削除すると、レクチンベースpreplatingによって、次の精製工程のために不可欠です。これが正しく管理されている場合は、ほとんどすべての細胞は、p75 NTRを （代表的な画像のための図3aを参照）を発現。腰椎運動ニューロンは、差動膵島- 1 / 2 10の上位と下位のレベルを表現するため膵島- 1 / 2の発現およびp75 NTRとの間の違いの理由はおそらくです。我々は正対負のセル（表1）に対して厳しいあったとして膵島- 1 / 2の発現の低レベルの場合、これはimmuncytochemical染色し、その後のカウントで我々の注意を脱出したかもしれない。さらに、表1から明らかな細胞が不可逆的に損傷していることを示すほんのトリパンブルーの陽性細胞が存在するとして、分離した細胞が正常な状態で手順を生き残ることを示しています。この変化をもたらすの手順では、また、マウス胎児からの混合遺伝子型の同腹仔の単胚とそれゆえの運動ニューロンの分離が可能になります。結論として、P75 NTR抗体を用いたパンニング手順には、この代替手段6は、可能なアプリケーションの範囲の点で類似していない場合は同一の能力を有しており、マウス胚の運動ニューロンのための安価で効率的な代替精製法を提供する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ポリ- DL -オルニチン臭化水素酸塩</td><td>シグマ</td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>インビトロジェン</td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td>ガラス製カバースリップ</td><td>サーモ</td><td></td><td> Ø 10または14ミリメートル</td></tr><tr><td>レクチン</td><td>シグマ</td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>ヌンク</td><td> 150350 </td><td> Nunclonデルタ面</td></tr><tr><td>馬血清</td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td>各バッチは、ミネソタ州の文化のためにテストする必要があります</td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> GIBCO </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> GIBCO </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td>シグマ</td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> GIBCO </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td>ステンレススチール、サイズ4または5 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ワージントン</td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター</td><td>シグマ</td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td>抗膵島- 1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td>細胞の培養上清</td></tr><tr><td>抗Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td>細胞の培養上清</td></tr><tr><td>抗P75 NTR </td><td>アブカム</td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。特異的な試薬や機器の表。

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

脊髄運動ニューロンは、初期胚神経系の発達を通じて分裂の段階に向けて開発し、続いて樹状突起と軸索を成長する。エクスプレスNkx6.1は脊髄運動ニューロン1のユニークな前駆細胞であることを神経管の神経上皮細胞。分裂の運動ニューロンは、その最終的な位置に向かって移動し、脊髄路2,3に沿って列に自分自身を整理するのに。すべてのこれらの差別化と位置付け運動ニューロンの90％以上は、転写因子の膵島1 / 2を表現する。彼らは、手足の筋肉だけでなく、体のそれらと内部器官を刺激する。なかでも、運動ニューロンは通常、脳由来神経栄養因子（BDNF）とニューロトロフィン-3（NT - 3）、トロポミオシン関連キナーゼBとC（TrkBは、TrkC）に対する高い親和性受容体を発現。彼らは、トロポミオシン関連キナーゼ（であるTrkA）4を発現しない。二つの高親和性受容体の横に、運動ニューロンは低親和性神経栄養因子受容体p75のNTRを表現してください。 P75 NTRは、成熟した神経栄養因子を結合する高親和性受容体よりもすべてのニューロトロフィンに似ていますが、低い親和性ですべての神経栄養因子を結合することができる。胚の脊髄内で、p75をNTRはもっぱら脊髄運動ニューロン5で表される。これは、周囲のセル6の大部分から細胞を浄化する運動ニューロンの単離技術を開発するために使用されています。 NTRが単一の実験に使用される抗体の量として高価な方法であることが判明しているp75の細胞外ドメインに対する特異的抗体（パン）の助けを借りて運動ニューロンを単離することにより、パンのために使用されるプレートの大きさに高いです。はるかに経済的な代替は、レクチンの使用です。レクチンは、特に同様に7 P75 NTRに結合することが示されている。次のメソッドは、代わりにp75のNTRの抗体のpreplating手順については、小麦胚芽凝集素を使って別の方法を説明します。レクチンは、p75 NTR抗体に非常に安価な代替品であり、レクチンを用いた精製グレードは、p75 NTR抗体のそれに匹敵する。胚の脊髄からの運動ニューロンは、この方法で単離し生き残ると神経突起を成長することができます。

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

脊髄から、マウス胚性運動ニューロンを分離する別の方法が説明されています。方法は、考慮にレクチンが低親和性神経成長因子受容体p75NTRにバインドすることができるという事実を取ります。このレクチンベースpreplatingはp75NTRに対する特異的抗体を持つと同様の精製が可能になります。

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K ビュー.  Ruhr-University Bochum. 脊髄から、マウス胚性運動ニューロンを分離する別の方法が説明されています。方法は、考慮にレクチンが低親和性神経成長因子受容体p75NTRにバインドすることができるという事実を取ります。このレクチンベースpreplatingはp75NTRに対する特異的抗体を持つと同様の精製が可能になります。

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...