זהו הפרוטוקול הראשון לטיהור ותרבות ראשוניים של נוירונים עיניים ועמוד השדרה בו זמנית וביעילות מעכברים עובריים. זה מאפשר את המחקר של מנגנונים שבבסיס מחלת נוירון מוטורי. פרוטוקול זה מוסיף מרכיב תרבות ויטרו oculomotor רומן למערכות קיימות ומספק מינים טהורים וגיל תואם תרבויות נוירון מוטורי בעמוד השדרה להשוואה.
ב טרשת נפוצה צידית amyotrophic, נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה להתנוון בעוד נוירונים oculomotor נחסך יחסית. השוואת תרבויות אלה יכולה לספק תובנות על מנגנון המחלה וטיפול. שיטה זו תאפשר מחקרים של המנגנונים שבבסיס התפתחות נוירונים מוטוריים, מחלות ופגיעות סלקטיבית.
מערכת התרבות שלנו מאפשרת אפיון של מורפולוגיה של נוירונים מוטוריים, ביולוגיה מולקולרית ואלקטרופיזיולוגיה. עבור אלה חדשים בטכניקה זו, אנו ממליצים על הרבה תרגול. ניתוח יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ניתוחים מרובים עשויים להידרש כדי להשיג נוירונים מספיק עבור התרבות העיקרית.
התחל על ידי קצירת Islet1 EGF עוברים חיוביים מעכבר בהריון כ 11.5 ימים לאחר ההפריה. לרסס את הבטן ביסודיות עם אתנול ולהסיר את הרחם עם מספריים microdissection סטרילי מאלץ ההלבשה אגודל. לשטוף בקצרה את הרחם PBS סטרילי.
ואז להעביר אותו לצלחת הניתוח מלא PBS סטרילי מקורר מראש. תחת האור הבהיר של המיקרוסקופ, הסר בזהירות את העוברים מהרחם באמצעות מספריים microdissection, מעצורי רוטב אגודל, ו Dumont 5 פינצטה. לאחר מכן השתמשו בכף מחוררת מיני מחוררת של מוריה סטרילית כדי להעביר כל עובר לבאגם נפרד של צלחת 24 באר מלאה בתרדמת חורף צוננת מראש E בינוני פלואורסצנטי נמוך בתוספת V27 1X.
תוך שמירה על הצלחת על הקרח, להעביר עובר אחד לצלחת ניתוח סטרילי ולכסות אותו לחלוטין עם קר קרח סטרילי של האנק פתרון מלח מאוזן או HBSS. השתמש פינצטה כדי להסיר את הפנים של העובר והזנב מבלי לפגוע midbrain. לאחר מכן מניחים את העובר נוטה עם גפיים תוחבות וזנב מצביע לכיוון החלק הקדמי של המיקרוסקופ.
השתמש פינצטה כדי לחתום לפתוח את הגג של החדר הרביעי על מנת ליצור פתח קטן. השתמש בפתיחה זו כדי לחבר פינצטה לחלל שנוצר בין החדר הרביעי לגג שלו. לנתח לאורך המשטח הגבי של rostral העובר לקליפת המוח רוחבי לצלחת הרצפה ועמוד המנוע.
ואז לפתוח את הרקמה נותח באופן ספר פתוח כדי לחשוף את GFP חיובי CN3 ו CN4 גרעינים. בזהירות להפריד את midbrain הגחוני מן העובר ולהסיר רקמת קרום המוח עם פינצטה וסכין microdissection. לנתח את הגרעין הדו-צדדי GFP חיובי CN3 ו CN4 הרחק צלחת הרצפה ורקמות GFP אחרות סביב טיפול כדי למנוע נגיעה או נזק הנוירונים.
אם אוספים גרעיני CN3 ו- CN4 נפרדים, חותכים לאורך האמצע של שני גרעינים אלה ולהשתמש פיפטה P1000 כדי לאסוף את רקמת המוח הגחוני נותחו עם HBSS מינימלי. מניחים אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר מלא בינוני ניתוח ולאחסן את הצינור על קרח עד דיסוציאציה. המשך למשוך עמודי אמצע גחוניים עוברים נוספים באותו צינור עד המספר הכולל עומד בדרישות הניסוי.
כדי לנתח את חוט השדרה הגחוני, שמור על העובר נוטה עם הראש הפונה לחזית המיקרוסקופ. החזק אותו עם זוג פינצטה אחד והכנס את קצה הזוג השני לחלק הקוואלי שלא נפתח של החדר הרביעי. פתח את שאר ההידברות וחוט השדרה בצורה הגבית על כל היקף rostrocaudal של העובר.
חותכים את רקמת הגב החל החדר הרביעי ועובדים לכיוון התעלה המרכזית של חוט השדרה caudal באמצעות מטלפים כמו מספריים. ואז להחזיק את העובר עם קבוצה אחת של פינצטה ולצבוט את הדש של רקמת הגב בכל צד עם הזוג השני. הסר את חוט השדרה הגחוני באמצעות סכין microdissection לנקב ישירות מתחת GFP חיובי SMN הרמת חוט השדרה הגחוני עם תנועות כמו מסור משני הצדדים.
חותכים את חוט השדרה רוחבי בגבול העליון של האיבר התחתון ולהסיר את החלק המותני צוואר הרחם. חותכים רוחבי ישירות מעל C1 שבו GFP הראשון חיובי צופר פרויקטים. מניחים את הצד הגבי של חוט השדרה הגחוני למעלה והחזיקו אותו על ידי לחיצה על הרקמה השלילית GFP בין עמודי ה- SMN החיוביים של GFP עם זוג פינצטה.
הסר את שאר mesenchyme המצורף, DRGs, וחוט השדרה הגבי על ידי גיזום שני הצדדים של עמוד SMN חיובי GFP עם סכין microdissection. השתמש פיפטה P1000 כדי לאסוף את רקמת חוט השדרה הגחוני נותח עם HBSS מינימלי למקם אותו צינור microcentrifuge שכותרתו 1.7 מיליליטר מלא בינוני ניתוח. לאחסן אותו על קרח עד דיסוציאציה ולהמשיך למשוך חוטי עמוד השדרה הגחוני עוברים נוספים באותו צינור.
הוסף את הנפח המתאים של פתרון פפאין לכל אחד צינורות microcentrifuge עם דגימות רקמה נותחו. להדק את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להתסיס את הצינורות כל 10 דקות על ידי אצבע מהבהבת. לאחר הדגירה, בעדינות triturate כל השעיה שמונה פעמים עם פיפטה P200 צנטריפוגה אותו ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
תן מחדש את כדורי התא עם הנפח המתאים של פתרון מעכבי אלבומין ovomucoid על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה. חזור על הצנטריפוגה. ואז להסיר בזהירות את supernatant עם פיפטה P1000.
תן שימוש חוזר בתאים בנפח המתאים של מדיום הניתוח. סנן את המתלים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. לאחר מכן, השתמש במיון FACS כדי לבודד תאים חיוביים של GFP שנותרו מ- CN3/CN4 ו- SMN.
לדלל את מתלי התא המבודדים עם תרבות נוירונים מוטוריים בינוני מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לצפיות המתאימות ולהוסיף 200 microliters של ההשעיה ל הבאר של צלחת PDL מצופה למינין 96 באר. תרבות הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור הקפדה לרענן את מדיום תרבות הנוירונים המוטוריים כל חמישה ימים. כאשר נוירונים מבודדים בהצלחה גדלו בתרבות, כמעט טהור ראשי CN3/CN4 ו SMN תרבויות הושגו ומתוחזקים במשך 14 ימים במבחנה.
הטיהורים של התרבויות ביומיים במבחנה היו 93.5% עבור CN3/CN4 ו 86.7% עבור SMN כאשר הוערך על ידי אימונוציטוכימיה עם סמן נוירון מוטורי Islet1 ו סמן עצבי TUJ1. הטהרונים הסתמכו במידה רבה על גיל העוברים ועל קביעת הסף המתאים לשערי GFP במהלך FACS. טוהר הנוירונים המבודדים מהעוברים E10.5 היה דומה לזה של עוברי E11.5.
עם זאת, הטוהר ירד באופן משמעותי כאשר נעשה שימוש בעוברים E13.5. כדי לקבוע אם CN3/CN4s ראשי ו SMNs הראו תגובות דיפרנציאליות לחצים ברשתית אנדופלזמית, התאים טופלו עם ריכוזים משתנים של חומצה Cyclopiazonic או רו"ח ביומיים במבחנה קבוע שלושה ימים מאוחר יותר עבור אימונוכיכימיה כדי להעריך את יחסי ההישרדות. מספר תאי העצב בת קיימא בכל מדגם נספר ויחסי ההישרדות חושבו.
מונוקולטורות CN3/CN4 היו עמידות באופן משמעותי יותר לטיפול ב- CPA בהשוואה למונוקולטורות SMN. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות רבות נוספות כדי לבחון נוירונים מוטוריים. כמה דוגמאות כוללות מחקרים של אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה של התא, שעתוק, או נגישות כרומטין.
