Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

Ce protocole est utile pour l’isolement enteroid dans une culture en plus d’étudier la prolifération cellulaire et la survie chez les enteroids. Les scientifiques peuvent appliquer cette technique à la culture des entéroïdes et étudier l’effet des médicaments et des cytokines inflammatoires sur les cellules épithéliales intestinales in vitro. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie d’eau de la maladie intestinale inflammatoire.

Nous appliquons cette méthode pour trouver quelques cytokines thérapeutiques. Cette méthode fournit un aperçu de la prolifération épithéliale intestinale et de la survie; en outre, il peut également être utilisé dans les organoïdes, cultivés autour de tissus autres que l’intestin. Pour isoler les cryptes intestinales et effectuer la culture entéroïde, utilisez des forceps tissulaires et trouvez des ciseaux d’iris pour disséquer environ huit centimètres d’iléum d’une souris de type sauvage euthanasié vieille de huit semaines.

Utilisez une seringue avec une aiguille d’alimentation gavage pour rincer l’iléum avec environ 40 millilitres de glace froide Dulbecco Phosphate-Tamponné Saline, puis couper dans le sens de la longueur avec des ciseaux et ouvrir l’iléum. Couper l’iléum en petits morceaux et les placer en cinq millilitres de DPBS stérile glacé dans un tube conique de 15 millilitres. Puis faire basculer l’échantillon pendant cinq minutes sur la glace.

Utilisez un contrôleur pipette pour aspirer le DPBS et le remplacer par 10 millilitres de tampon froid. Après avoir basculé pendant 30 minutes sur la glace, utilisez le contrôleur pipette pour aspirer le tampon un et remplacer par 10 millilitres de tampon froid deux. Puis agiter de deux à trois minutes à la main à environ 80 secousses par minute.

Après avoir secoué, inspecter une gouttelette de vingt micro litres de tampon deux contenus sous un microscope pour s’assurer qu’il ya des cryptes avec des cellules granulaires Paneth. Filtrez le tampon de deux contenus à l’aide d’une passoire cellulaire stérile de 70 microns et recueillez le tampon filtré dans un tube conique de 50 millilitres. Pipette 20 microlitres de filtrate sur la diapositive pour compter les cryptes.

Transférez un volume suffisant du tampon filtré deux contenus pour s’assurer qu’il y a environ 500 cryptes par puits. Tournez vers le bas à 150 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirez soigneusement le supernatant. Resuspendez les cryptes en 50 microlitres de matrice membranaire sous-sol par 500 cryptes.

Pipette de haut en bas en prenant soin d’éviter les bulles. Placez une gouttelette de 50 microlitres de matrice membranaire du sous-sol et un mélange de crypte au centre d’un puits d’une plaque de puits de 24 puits. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour polymériser la matrice membranaire du sous-sol.

Après 30 minutes de polymérisation, ajouter soigneusement 600 microlitres de miniguts à chaque puits. Retournez la plaque à l’incubateur de 37 degrés Celsius et observez au microscope chaque jour, en changeant les médias tous les deux à trois jours. Pour passer les entéroïdes, placez la plaque de culture tissulaire sur la glace, aspirez le média et ajoutez un millilitre de DPBS froid à chaque puits.

Utilisez une pointe P1000 pour pipette de haut en bas jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux matriciels. Passez l’échantillon à travers une seringue d’insuline d’un millilitre et vers le bas dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir tourné vers le bas pendant cinq minutes à 150 fois G et quatre degrés Celsius, utilisez une pipette pour enlever le DPBS.

Suspendre à nouveau les entéroïdes dans 50 microlitres de matrice membranaire du sous-sol par puits. Placez la plaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre à la matrice membranaire du sous-sol de polymériser. Ensuite, superposez chaque puits avec 600 microlitres de supports ENR et retournez la plaque à l’incubateur.

Cultivez des entéroïdes pendant cinq à sept jours avant de les passer dans une nouvelle plaque de puits 24 en utilisant un rapport de fractionnement de un à deux. Ajouter 600 microlitres de milieu ENR à chaque puits, puis incuber les entéroïdes pendant quatre à cinq jours dans l’incubateur de 37 degrés Celsius. Mettre en place le groupe témoin des entéroïdes non traités et le groupe expérimental d’entéroïdes traités avec cinq nanogrammes par millilitre d’interleukine-22.

Préparez au moins trois répliques pour chaque groupe. Ajouter 600 microlitres de milieu EdU à chaque puits d’entéroïdes, sauf un puits à utiliser comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond. Incuber la plaque pendant deux heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius.

Pour récolter les entéroïdes de la matrice membranaire du sous-sol, utilisez un contrôleur pipette pour aspirer edu moyen et laver une fois avec DPBS. Ajouter ensuite un millilitre de DPBS. Utilisez une pointe de pipette P1000 pour pipette de haut en bas jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux solides de matrice membranaire du sous-sol.

Transférer l’échantillon dans un tube de 15 millilitres et faire tourner à 300 fois G pendant cinq minutes avant de jeter le supernatant. Ajouter 500 microlitres d’enzymes de dissociation cellulaire et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pointe de pipette P200 pour pipette de haut en bas et briser les entéroïdes en cellules individuelles.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de dulbecco’s Modified Eagle Medium contenant 10% de sérum bovin fœtal, et pipette à plusieurs reprises avec une pointe de pipette P1000. Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, et aspirant le supernatant, nous suspendons les cellules en un millilitre de DPBS. Pour effectuer la fixation et la perméabilisation des cellules, transférez d’abord la suspension cellulaire à un tube d’un point de cinq millilitres, tournez vers le bas à 300 fois G pendant cinq minutes, et jetez le supernatant.

Nous suspendons les cellules en un millilitre de 4% de paraformaldéhyde et fixons pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, aspirer le supernatant avec une pointe de pipette. Lavez les cellules une fois avec le DPBS, et tournez vers le bas à nouveau pour enlever le surnatant.

Resuspendez les cellules avec un millilitre de 0,5% de surfactant non ionique, et incubez pendant 10 minutes à température ambiante avant de laver les cellules avec du DPBS comme avant. Pour détecter l’EdU, ajouter 100 microlitres de cocktail de réaction à chaque tube de 1,5 millilitre. Resuspendez les cellules et protégez-les de la lumière, incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, aspirez doucement la solution de réaction avec une pointe pipette Ajouter 0,5% de penetrant surfactant non ionique à chaque tube pour le laver une fois à température ambiante. Après centrifugation comme avant, nous suspendons les cellules en un millilitre de DPBS. Filtrer les cellules résuspendues à l’aide d’une passoire de 40 microns et recueillir les cellules filtrées dans un tube conique de 15 millilitres.

Effectuez des faits sur la détection de la machine dès que possible. Sélectionnez le canal et la tension appropriés pour l’analyse de cytométrie de débit. Pour la stratégie de gating, dessinez une parcelle pseudocolor FSC-A versus SSC-A et distribuez la plupart des cellules à la plage visible de la carte des points en ajustant la tension.

Sélectionnez la population cellulaire comme R1 et excluez les débris cellulaires dans le coin inférieur gauche. De la population de cellules R1, établir une parcelle pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Réglez la porte pour sélectionner les cellules individuelles désignées comme R2 et exclure les touffes cellulaires.

À partir de la population de cellules R2, établir l’intensité de fluorescence par rapport à la parcelle de nombre cellulaire et utiliser le contrôle négatif pour définir la porte. La région du signal fluorescent est une région cellulaire positive désignée R3.Comparez le rapport de ces cellules positives EdU entre les groupes expérimentaux et de contrôle. De petites cryptes intestinales ont été isolées et cultivés sous forme d’entéroïdes dans la matrice membranaire du sous-sol.

Les entéroïdes ont commencé à former des bourgeons deux jours après l’isolement. Le sixième jour, les entéroïdes avaient beaucoup de bourgeons avec beaucoup de débris dans le lumen. Les entéroïdes étaient prêts à passer à ce stade.

Les entéroïdes ont été traités avec IL-22 pendant 3 jours, après quoi l’ADN synthétique a été étiqueté avec EdU en rouge pour indiquer la prolifération cellulaire. Il-22 enteroids traités ont montré un nombre accru de cellules positives d’EdU. Il-22 a augmenté les cellules proliférantes de 40,1% à 83,5%, telles qu’analysées par cytométrie de flux.

Le traitement d’IL-22 a également augmenté la mort cellulaire dans les enteroids indiquée par la coloration d’iodure de propidium dans le rouge. Il-22 a augmenté les cellules mortes de 4,9% à 16,2%, telles qu’analysées par cytométrie de flux. Au cours de la crypte de progrès d’isolement juste secousse est nécessaire après avoir ajouté tampon pour s’assurer que suffisamment de cryptes sont secoués vers le bas.

Nous vous conseillons d’inspecter le contenu au microscope. Après cette procédure, nous pouvons également quantifier les types d’épithéliales différenciées et les entéroïdes en utilisant spécifiquement Cette méthode aidera les chercheurs à étudier la différenciation épithéliale intestinale chez les entéroïdes. Après son développement, cette question ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la gastroentérologie pour explorer les questions développementales ou pathologiques dans la coupe.