이 프로토콜은 장로이드에서 세포 증식 및 생존을 조사하는 것 외에도 배양에서 장내 절연에 유용합니다. 과학자들은 이 기술을 배양 장로이드에 적용하고 약물과 염증성 사이토카인이 시험관 내 상피 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 염증성 장 질환의 물 치료로 확장됩니다.
우리는 몇 가지 치료 세포 사동을 찾기 위해이 방법을 적용합니다. 이 방법은 장 상피 증식 및 생존에 대한 통찰력을 제공합니다.이 방법은 내장 이외의 조직 주위에 배양된 오르가노이드에서도 사용될 수 있습니다. 장 내 지하실을 분리하고 장성 문화를 수행하려면 조직 집게를 사용하고 홍채 가위를 찾아 안락사 된 8 주 된 야생 형 마우스에서 약 8 센티미터의 ileum을 해부하십시오.
가공 먹이 바늘을 가진 주사기를 사용하여 얼음 차가운 덜베코의 인산염 완충 식염수약 40 밀리리터로 일루를 플러시한 다음 가위로 길게 자르고 장위를 엽니다. 일루를 작은 조각으로 자르고 15 밀리리터 원추형 튜브에 멸균 얼음 차가운 DPBS 5 밀리리터에 넣습니다. 그런 다음 얼음에 5 분 동안 샘플을 바위.
파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 콜드 버퍼 10 밀리리터로 교체하십시오. 얼음에서 30분 동안 흔들린 후 파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 버퍼 하나를 흡인하고 콜드 버퍼 2의 10 밀리리터로 교체하십시오. 그런 다음 분당 약 80 쉐이크에서 손으로 2~3분간 흔들어 줍니다.
흔들린 후 현미경으로 2개의 내용물을 버퍼링한 2개의 미세 리터 액자를 검사하여 세분화된 창구 세포가 있는 토굴이 있는지 확인합니다. 70미크론 멸균 세포 스트레이너로 두 가지 내용을 필터로 버퍼링하고 50 밀리리터 원내 튜브에서 여과된 버퍼를 수집합니다. 피펫 20 마이크로리터가 슬라이드에 여과되어 토굴을 계산합니다.
필터링된 버퍼 두 컨텐츠의 충분한 볼륨을 전송하여 웰당 약 500개의 암호화가 있는지 확인합니다. 섭씨 4도에서 150회 G로 회전한 다음, 수퍼네이트도 조심스럽게 흡인합니다. 500 개의 지하실 중구 당 지하 막 매트릭스의 50 마이크로 리터에서 토굴을 다시 일시 중지합니다.
거품을 피하기 위해 주의하는 파이펫 위아래로. 지하 멤브레인 매트릭스의 50 마이크로 리터 액자를 놓고 24 웰 플레이트의 한 우물의 중앙에 토굴 믹스를 놓습니다. 지하 막 매트릭스를 중합하기 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
중합 30분 후, 각 웰에 600마이크로리터의 미니구트 미디어를 조심스럽게 추가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터로 되돌리고 매일 현미경으로 관찰하여 2~3일마다 미디어를 변경합니다. 엔테로이드를 통과하려면 조직 배양판을 얼음 위에 놓고, 미디어를 흡인하고, 각 웰에 1밀리리터의 차가운 DPBS를 넣습니다.
P1000 팁을 사용하여 매트릭스 청크가 남아 있지 않은 때까지 위아래로 파이펫을 사용합니다. 샘플을 1밀리리터 인슐린 주사기를 통과하여 15밀리리터 원뿔형 튜브로 내려갑니다. 150회 G와 섭씨 4도에서 5분간 회전한 후 파이펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다.
잘 당 지하 막 매트릭스의 50 마이크로 리터에서 엔테로이드를 다시 중단합니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 중합할 수 있도록 30분 동안 37도의 섭씨 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 ENR 미디어의 600 마이크로리터로 각 우물을 오버레이하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
엔테로이드를 5~7일 동안 늘라 한 후 1~2개의 분할 비율을 사용하여 새로운 24웰 플레이트로 패싱합니다. 각 우물에 600 마이크로리터의 ENR 배지를 추가한 다음, 37°C인 인큐베이터에서 4~5일 동안 엔테로이드를 배양합니다. 치료되지 않은 엔테로이드의 대조군과 인터류키인-22의 밀리리터당 5나노그램으로 처리된 장로이드의 실험군을 설정한다.
각 그룹에 대해 적어도 세 개의 복제를 준비합니다. 배경 뺄셈에 대한 음의 제어로 사용하는 것을 제외하고 엔테로이드의 각 웰에 EdU 배지 600 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도 인큐베이터에서 접시를 2시간 동안 배양합니다.
지하 멤브레인 매트릭스에서 엔테로이드를 수확하려면 파이펫 컨트롤러를 사용하여 EdU 배지를 흡인하고 DPBS로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 DPBS의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. P1000 파이펫 팁을 사용하여 고체 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 때까지 위아래로 파이펫을 사용하십시오.
샘플을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 300회 G로 회전한 후 상퍼를 폐기합니다. 세포 해리 효소 500마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 15분간 배양합니다. 그런 다음 P200 파이펫 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 피펫하고 엔테로이드를 단일 셀로 분해합니다.
다음으로, 10%의 태아 소 세럼을 함유한 덜벡코의 수정된 이글 매체 3밀리리터를 추가하고 P1000 파이펫 팁이 있는 파이펫을 반복적으로 넣습니다. 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리하고 상체를 경각한 후 DPBS의 1 밀리리터에서 세포를 중단합니다. 세포의 고정 및 투과화를 수행하기 위해 먼저 세포 현탁액을 1점 5 밀리리터 튜브로 옮기고, 5분 동안 300회 G로 회전하고, 상복부을 폐기한다.
우리는 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리 리터에서 세포를 중단하고 실온에서 15 분 동안 고정합니다. 원심분리 후 5분 동안 300회 G로 피펫 끝으로 상퍼를 흡인시합니다. DPBS로 세포를 한 번 씻고 다시 회전하여 상체를 제거합니다.
0.5%의 비이온 계면활성제의 1밀리리터로 세포를 다시 중단하고, 이전과 같이 DPBS로 세포를 세척하기 전에 실온에서 10 분 동안 배양합니다. EdU를 감지하려면 각 1.5 밀리리터 튜브에 100 마이크로리터의 반응 칵테일을 추가합니다. 세포를 다시 중단하고 빛으로부터 보호하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.
5분 동안 300회 G에서 원심분리한 후 파이펫 끝으로 반응 용액을 부드럽게 흡인한 후, 각 튜브에 0.5% 비이온 계면활성제 관통제를 추가하여 실온에서 한 번 세척합니다. 이전과 같이 원심 분리에 따라, 우리는 DPBS의 1 밀리리터에서 세포를 중단합니다. 40 미크론 여과기를 통해 다시 중단된 세포를 걸러내고 15밀리리터 원내 튜브에서 여과된 세포를 수집합니다.
가능한 한 빨리 기계 감지에 대한 사실을 수행합니다. 유동 세포 분석에 적합한 채널 및 전압을 선택합니다. 게이팅 전략의 경우, FSC-A 대 SSC-A 의사 색상 플롯을 그리고 대부분의 셀을 전압을 조정하여 도트 맵의 가시 범위에 분배합니다.
세포 집단을 R1로 선택하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 셀 이물질을 제외합니다. R1 세포 집단에서 FSC-H 의사색상 플롯대 FSC-A를 설정합니다. 게이트를 설정하여 R2로 지정된 단일 셀을 선택하고 셀 덩어리를 제외합니다.
R2 세포 집단으로부터, 형광 강도를 세포 수 플롯대 확립하고 네거티브 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정한다. 형광 신호의 영역은 R3.실험 및 대조군 사이의 이러한 EdU 양성 세포의 비율을 비교하는 양양성 세포 영역지정입니다. 작은 장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장로이드로 분리되고 배양되었다.
엔테로이드는 고립 후 이틀 후에 싹을 형성하기 시작했습니다. 6일째에는 루멘에 많은 파편이 있는 장신봉오리가 많았다. 엔테로이드는 이 단계에서 통과할 준비가 되어 있었습니다.
엔테로이드는 3일 동안 IL-22로 치료되었고, 그 후 합성 DNA는 세포 증식을 나타내기 위해 EdU로 적색으로 표지되었다. IL-22 치료 된 엔테로이드는 EdU 양성 세포의 증가 수를 나타냈다. IL-22는 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이 증식 세포를 40.1%에서 83.5%로 증가시켰습니다.
IL-22 치료는 또한 적색으로 염색하는 프로피듐 요오드에 의해 표시된 장내 세포 사멸을 증가시다. IL-22는 유동 세포측정에 의해 분석된 대로 죽은 세포를 4.9%에서 16.2%로 증가시켰습니다. 충분한 토굴이 흔들리도록 버퍼를 추가한 후 토굴 격리 진행 과정에서 공정흔들림이 필요합니다.
현미경으로 내용을 검사하는 것이 좋습니다. 이 절차에 따라, 우리는 또한 특정이 방법을 사용하여 차별화 된 상피 유형과 엔테로이드를 정량화 할 수 있습니다 연구원은 장 상피 분화를 조사하는 데 도움이 될 것입니다 장 상피 분화엔트. 개발 후이 질문은 절단에 발달 또는 병리학 적 질문을 탐구하는 위장학 분야의 연구원을위한 방법을 포장합니다.
