Name: in vivo mouse model of spinal implant infection
Uploaded: 2020-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
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著者らは、これらの実験の主要な資金源として、北米小児整形外科学会のバイオメット脊椎助成金と国立衛生研究所の臨床トランスレーショナルサイエンス研究所KL2助成金、およびHH Lee Surgical Research Grantの両方を受け取ったことに感謝したいと思います。

すべての動物は、動物福祉法(AWA)、1996年の実験動物のケアと使用に関するガイド、実験動物の人道的なケアと使用に関するPHSポリシー、および動物の飼育と使用に関するトレーニングマニュアルに記載されている機関の方針と手順に規定されている連邦規制に定義されている適正動物慣行に厳密に従って取り扱われました。 また、すべての動物実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物研究委員会(ARC)によって承認されました。
1. 黄色ブドウ球菌 の生物発光株の選択
<ol><li>生物発光 黄色ブドウ球菌 Xen36株を目的の接種物として使用します。 注:この株は、敗血症患者からの臨床分離株である親株黄色 ブドウ球菌 ATCC-49525に由来しました。 黄色ブドウ球菌 Xen36は、最適化され、宿主のネイティブプラスミドに組み込まれた ルクスABCDEオペロンを独自に利用しています。19 その結果、Xen36株は、ピーク波長発光が490nmの青緑色の生物発光光を生成することができる。この発光シグナルは、生きている代謝活性細菌によってのみ生成されます。</li>
</ol>2. S.の準備接種のための黄色ブドウ球菌
<ol><li>ルリアブロスに200 μg/mLのカナマイシンと1.5%寒天を加えて、ルクスオペロンに結合したカナマイシン耐性遺伝子を利用して、黄色ブドウ球菌Xen36を潜在的な汚染物質から単離します19。</li>
	<li>黄色 ブドウ球菌 Xen36細菌をトリプシン大豆寒天プレート(トリプシン大豆ブロス[TSB]と1.5%寒天培地)にストリークし、37°Cで12〜16時間インキュベートします。</li>
	<li>黄色ブドウ球菌Xen36の単一コロニーを単離し、振とうインキュベーター(200rpm)で37°Cで12〜16時間TSBで個別に培養します。</li>
	<li>得られた培養液を1:50の比率で希釈します。</li>
	<li>37°Cでさらに2時間培養し、中対数期の細菌を単離します。</li>
	<li>ペレット化、再懸濁、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でのバクテリアの洗浄を3回行います。</li>
	<li>600nmでの吸光度を測定します。理想的なOD600は0.700〜0.750で、これは4x105 CFU/mLに相当します。段階希釈を行い、目的の細菌接種(1 x 103 CFU/2 μL)を達成します。 注:慢性感染症の確立のためのXen36の最適濃度は、1 x 103 CFUであることがわかりました。バクテリアの投与量が少ないと宿主の免疫系によって除去され、投与量が多いと創傷破壊を引き起こしました。創傷の破壊は、深部インプラント感染と表在性創傷感染を区別しないため、このモデルでは回避されます(図1)20。</li>
</ol>3.マウス
<ol><li>12週齢の雄のC57BL/6J野生型マウスを使用。</li>
	<li>ハツカネズミを一度に最大4匹のケージに入れます。</li>
	<li>常に水を利用できるようにしてください。12時間の明暗サイクルを維持し、サイクルの暗期には実験を行わないでください。</li>
	<li>給餌にはアルファルファを含まないチャウを使用し、蛍光シグナル伝達に干渉する可能性があるため、給餌に使用してください。</li>
	<li>研究スタッフまたは獣医スタッフにマウスを毎日評価してもらい、実験全体を通してマウスの健康状態を確保します。</li>
</ol>4. マウスの外科的処置
<ol><li>マウスをイソフルラン(2%)チャンバーに約5分間入れて麻酔を誘発します。呼吸が覚醒時よりもリズミカルでゆっくりと保たれ、有害な刺激(外科的操作、つま先のつまみなど)に反応して変化しないように呼吸を監視することにより、適切な麻酔深度を確認します。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスを調製ステーションに移し、げっ歯類のバリカンで仙骨から上部胸椎までの毛を取り除きます。</li>
	<li>ベタジン溶液とイソプロピルアルコールを交互に3回洗浄して皮膚を洗浄および滅菌します。</li>
	<li>腹臥位で麻酔および滅菌したマウスを、鼻錐形を介して吸入イソフルラン(2%)を投与して麻酔を維持した無菌手術用ベッドに移します。</li>
	<li>腰を最大限に曲げ、脊椎の高さで膝の位置を特定して、腰椎4椎体に近づけます。</li>
	<li>15枚刃の外科用メスで皮膚を縦方向に2cm切開します。</li>
	<li>棘突起を触診して正中線を確認し、骨まで切開を続けます。</li>
	<li>L4棘突起の右側を骨膜下的に解剖し、横突起まで横方向に伸ばします。</li>
	<li>吸収性の編組縫合糸サイズ5-0のセファラッドとコーダッドを筋膜を通してL4ボディに通し、将来の閉鎖に備えて開いたままにします。</li>
	<li>25Gの脊椎針を使用して、25Gの脊椎針を使用してL4の棘突起をリームし、長い腕の産卵頭を持つ椎弓に沿って直径0.1mm、長さ1cmの「L字型」の外科用グレードのステンレス鋼インプラントを挿入します。</li>
	<li>1 x 103 CFU/2 μLの生物発光 黄色ブドウ球菌 Xen36をインプラントに接種し、すべての溶液がインプラントに接触するように注意します。</li>
	<li>約10秒待ってから、接種後に以前に通過した吸収性縫合糸を結び、インプラントに接種物を確実に封じ込めます。</li>
	<li>吸収性縫合糸でランニングファッションで肌を閉じます。</li>
	<li>ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の皮下注射により鎮痛剤を直ちに投与し、その後3日間は12時間ごとに投与します。</li>
	<li>加熱パッドでマウスを回収し、通常の活動に戻るのを監視します。</li>
	<li>術後のX線写真を入手して、インプラントの適切な配置を確認します。</li>
</ol>5. 細菌量測定のための縦断的生体内生物発光イメージング
<ol><li>マウスに吸入イソフルラン(2%)を麻酔する。呼吸が覚醒時よりもリズミカルでゆっくりと保たれ、有害な刺激(外科的操作、つま先のつまみなど)に反応して変化しないように呼吸を監視することにより、適切な麻酔深度を確認します。</li>
	<li>げっ歯類のバリカンで仙骨から胸椎の上部まで毛を取り除きます。</li>
	<li>マウスを生物発光イメージングプラットフォームの視野にロードして、in vivo生物発光イメージング(BLI)を実行します19。</li>
	<li>5分間の取得時間で生物発光シグナルを捕捉します。視野角15cm(B)の大きなビニング設定を利用します。</li>
	<li>術後0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28、および35日目(または特定の実験デザインに基づく他の日)に手順5.1〜5.4を繰り返して、細菌負荷を監視します。</li>
	<li>BLIデータをカラースケールで表示し、グレースケール写真に重ね合わせます。BLIソフトウェアを使用して標準的な卵形関心領域(ROI)を分離し、総フラックス(フォトン/秒)または平均最大フラックス(フォトン/秒/センチメートル2/ステラジアン)のBLIを定量化します。</li>
</ol>6. インプラントや周辺組織に付着した細菌の定量化
<ol><li>AVMAガイドラインに従って、POD 35または選択した代替の術後日でマウスを安楽死させます。二次性子宮頸部脱臼を伴う安楽死を確認します。</li>
	<li>ステップ4.3に従って背側皮膚を滅菌し、マウスを無菌手術野にうつ伏せにします。</li>
	<li>15枚刃の外科用メスを使用して、前の切開部を鋭く切開します。</li>
	<li>滅菌ハサミを使用して、L4棘突起を鈍く解剖し、外科的インプラントを特定します。</li>
	<li>ニードルドライバーを使用して、インプラントを静かにひねり、L4棘突起の位置から取り外します。</li>
	<li>滅菌鉗子とハサミを使用して、外科用インプラントのすぐ周囲の約0.1 gの棘突起骨と軟部組織を採取し、4つの鋭い均質化ビーズを備えた小さな円錐形のサイチューブに1 mLのPBSを入れます。</li>
	<li>収穫前と収穫後に円錐形チューブを計量することにより、軟部組織の重量を記録します。</li>
	<li>インプラントを0.5 mLの0.3% Tween-80 in TSBに入れ、15分間超音波処理します。</li>
	<li>得られたインプラント懸濁液を2分間ボルテックスし、12〜16時間一晩培養します。</li>
	<li>ホモジナイザーを使用して、インプラントを囲む 1 ml PBS に以前に配置した軟部組織と有棘突起を均質化します。</li>
	<li>得られた軟部組織懸濁液を5分間ボルテックスし、12〜16時間一晩培養します。</li>
	<li>一晩培養した後、インプラントと周囲の組織からCFUをそれぞれカウントします。軟部組織では収穫された総CFU/g、超音波処理されたインプラントではCFU/mLとして値を表現します。</li>
</ol>

<ol>
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著者には開示すべき利益相反はありません。

脊椎のインプラント関連の感染症は、患者の転帰不良の前兆です1,2,3,4,5。体内の他の多くの領域とは異なり、脊椎の感染したハードウェアは、不安定性や神経学的障害のリスクがあるため、取り除くことができないことがよくあります。全身抗生物質療法に耐性のある?...

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Benjamin V. Kelley1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
to:
Benjamin V. Kelley1 
Christopher Hamad1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Zeinab Mamouei1 
Rene Chun1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Brandon Gettleman3 
Autreen Golzar2 
Adrian Lin2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles 
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

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Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

この方法の目的は、脊椎インプラント感染症(SII)の新しいマウスモデルを記述することです。このモデルは、in vivoで宿主、病原体、および/またはインプラント変数の影響を柔軟に評価するための安価で正確なツールを提供するように設計されています。このモデルで脊椎インプラント感染症の潜在的な治療法と治療戦略をテストすることは、より大きな動物モデルや臨床試験に適用する前に研究開発を導くことを目的としています。
脊椎手術後のインプラント関連の感染症は壊滅的な合併症であり、残念ながら、選択的脊椎手術を受けている患者の約3〜8%に発生します1,2,3,4,5およびマルチレベルまたは再手術を受けている患者の最大65%6。脊椎インプラント感染症の治療には、多くの場合、複数回の入院、複数回の手術、および長期の抗生物質療法が必要です。SIIは、神経学的障害、障害、死亡リスクの増加など、患者の転帰不良の前兆です。SIIの管理は非常に費用がかかり、患者1人あたり90万ドル以上の費用がかかります7。
黄色ブドウ球菌は、SII 8,9,10,11の最も一般的な病原体です。細菌は、手術中に直接、術後の傷口から、または後に血行性の広がりを介してハードウェアに種をまく可能性があります。金属インプラントの存在下で、黄色ブドウ球菌は抗生物質療法や免疫細胞から細菌を保護するバイオフィルムを形成します。感染したハードウェアの除去は、感染を効果的に根絶するのに役立つ可能性がありますが、これは、不安定化を引き起こし、神経学的障害のリスクを冒さずに脊椎で実行できないことがよくあります12。
感染したハードウェアを摘出できない場合、SIIを予防、検出、治療するための新しいアプローチが必要です。歴史的に、新しい治療法の安全性と有効性を効率的に評価するためのSIIの動物モデルは限られていました。SIIの以前の動物モデルでは、多数の動物と、コロニーカウント、組織学、培養など、安楽死を必要とするデータポイントの収集が必要でした13,14,15。これらのモデルは、縦断的なin vivoモニタリングを欠いているため、1匹の動物につき1つのデータポイントしか提供しないため、高価で非効率的です。
人工膝関節置換術感染のマウスモデルを研究した以前の研究では、感染負荷を縦断的に監視するための非侵襲的in vivo光学イメージングの価値と精度が確立されました16。生物発光の検出により、1匹の動物の細菌負荷を縦断的に、人道的、正確、効率的に定量化することができます。さらに、以前の研究では、in vivo生物発光とインプラントに接着したCFUとの間に高い相関関係があることが実証されています17。感染を経時的に追跡する能力は、インプラント関連の感染のより微妙な理解につながりました。さらに、このように縦断的感染を監視することで、抗生物質療法と新規抗菌薬の有効性を正確に評価できるようになりました16,17,18。
これらのツールを活用して、術後の脊椎インプラント感染のモデルを開発し、検証しました。提示された方法では、生物発光黄色ブドウ球菌Xen36の接種物を利用して、細菌負荷を縦断的に監視するためのSIIのin vivoマウスモデルを確立します16,17,18。この新しいモデルは、より大きな動物モデルや臨床試験に適用する前に、SIIの潜在的な検出、予防、および治療戦略を効率的にテストするための貴重なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>Analytical Balance ME104</td><td>Mettler Toledo</td><td>30029067</td><td>120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base</td></tr><tr><td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD 211825</td><td>BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)</td></tr><tr><td>Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208300</td><td>Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord</td></tr><tr><td>Bioshield 720+ swinging bucket rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003183</td><td>Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>CPX952217R</td><td>*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td>The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling&amp;trade; minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO&amp;reg; tubes or snap-cap Eppendorf&amp;reg; Safe-lock&amp;trade; tubes.</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>66118-10</td><td>The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be&lt;br/&gt; used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for&lt;br/&gt; traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine&lt;br/&gt; sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been&lt;br/&gt; designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.</td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>Single 150L</td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5 Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148590</td><td>The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data&amp;mdash;and answers&amp;mdash;on anatomical and molecular aspects of disease.</td></tr><tr><td>MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4450</td><td>Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz</td></tr><tr><td>PBS, Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP24384</td><td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td>24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid</td></tr><tr><td>SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004261</td><td>Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus - Xen36</td><td>Perkin Elmer</td><td>119243</td><td>Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.</td></tr><tr><td>TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V</td><td>Heidolph Tuttnauer</td><td>23210401</td><td>Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP338-500</td><td>Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction</td></tr><tr><td>Vortex mixer VX-200</td><td>Labnet Internation</td><td>S0200</td><td>120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm</td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride</td><td>Pfizer Injectables/Hospira</td><td>00409-4888-10</td><td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td></tr></tbody></table>

in vivo mouse model of spinal implant infection

脊椎インプラント感染症は、診断が困難であり、外科的根絶が機械的脊椎の安定性と相反するため、予後不良の前兆です。この方法の目的は、脊椎インプラント感染症の潜在的な治療法と治療戦略をテストするための安価で迅速、かつ正確なin vivoツールを提供するために作成された脊椎インプラント感染症(SII)の新しいマウスモデルを説明することです。
この方法では、12週齢のC57BL/6J野生型マウスのL4棘突起にステンレス鋼のkワイヤーを固定し、黄色ブドウ球菌Xen36細菌の生物発光株の1 x 103 CFUを接種する後方アプローチ脊椎手術のモデルを提示します。次に、マウスを術後0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28、および35日目のin vivoで生物発光について縦断的に画像化します。標準化された視野からの生物発光イメージング(BLI)信号を定量化して、in vivoの細菌負荷を測定します。
インプラントやインプラント周囲組織に付着した細菌を定量するために、マウスを安楽死させ、インプラントや周囲の軟部組織を採取します。バクテリアは超音波処理によってインプラントから分離され、一晩培養され、次にコロニー形成単位(CFU)がカウントされます。この方法から得られた結果には、in vivo 黄色ブドウ球菌 の生物発光によって測定された縦断的細菌数(平均最大フラックス)と安楽死後のCFU数が含まれます。
これまでの脊椎感染症の動物モデルには、侵襲的なex vivo組織分析が含まれていましたが、この論文で紹介するSIIのマウスモデルは、生物発光細菌の非侵襲的でリアルタイムのin vivo光学イメージングを活用して、静的組織研究に取って代わります。このモデルの用途は多岐にわたり、代替の生物発光細菌株の利用、宿主の免疫応答を同時に研究するための他の種類の遺伝子改変マウスの組み込み、抗生物質やインプラントコーティングなどの新しい診断および治療モダリティの現在または調査が含まれます。

ここで紹介する手順は、SIIのin vivoマウスモデルにおける抗生物質レジメンの有効性を評価するために使用されました。具体的には、バンコマイシンとリファンピンの併用抗生物質療法の有効性を、バンコマイシン単剤療法および未治療の感染対照と比較した。
手術に先立ち、マウスは併用療法、単剤療法、または感染対照のいずれかに無作為に割り付けられた。サンプ?...

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In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

プロトコルはステンレス鋼kワイヤー インプラントが生物発光黄色 ブドウ球 菌Xen36と感染する脊髄インプラント伝染の新しい生体内のマウス モデルを記述する。細菌負荷は、生物発光イメージングで縦断的に監視され、安楽死後のコロニー形成ユニット数で確認されます。

脊椎インプラント感染のin vivoマウスモデル

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

in-vivo-mouse-model-of-spinal-implant-infection

Research

JoVE Journal

Medicine

2.3K ビュー.  University of California Los Angeles. プロトコルはステンレス鋼kワイヤー インプラントが生物発光黄色 ブドウ球 菌Xen36と感染する脊髄インプラント伝染の新しい生体内のマウス モデルを記述する。細菌負荷は、生物発光イメージングで縦断的に監視され、安楽死後のコロニー形成ユニット数で確認されます。

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An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve microenvironment. This type of invasion is exhibited by a variety of cancer types, and very frequently is found in pancreatic cancer. The microscopic size of nerve fibers within mouse pancreas renders the study of PNI difficult in orthotopic murine models. Here, we describe a heterotopic in vivo model of PNI, where we inject syngeneic pancreatic cancer cell line Panc02-H7 into the murine sciatic nerve. In this model, sciatic nerves of anesthetized mice are exposed and injected with cancer cells. The cancer cells invade in the nerves proximally toward the spinal cord from the point of injection. The invaded sciatic nerves are then extracted and processed with OCT for frozen sectioning. H&amp;E and immunofluorescence staining of these sections allow quantification of both the degree of invasion and changes in protein expression. This model can be applied to a variety of studies on PNI given its versatility. Using mice with different genetic modifications and/or different types of cancer cells allows for investigation of the cellular and molecular mechanisms of PNI and for different cancer types. Furthermore, the effects of therapeutic agents on nerve invasion can be studied by applying treatment to these mice.

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

We describe an in vivo murine model of perineural invasion by injecting syngeneic pancreatic cancer cells into the sciatic nerve. The model allows for quantification of the extent of nerve invasion, and supports investigation of the cellular and molecular mechanisms of perineural invasion.

神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

がん研究

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

合わせた<em&gt;インビボ</em&gt;光とμCTイメージングマウスにおける整形外科インプラント感染で感染症、炎症、および骨解剖学を監視する

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

医学

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

<meta charset="utf8"></head><body>脊髄神経膠腫の効率的かつ高精度なマウスモデルの開発

Surgical Transplantation of Tumor Cells into the Spinal Cord of Mice

Spinal cord gliomas are commonly malignant tumors of the spinal cord, leading to a high rate of disability. However, uniform treatment guidelines and comprehensive data on spinal cord gliomas remain limited due to the lack of suitable preclinical animal models. Developing a simple and reproducible animal model has become essential for advancing basic and translational research. A murine model is ideal, as the murine spinal cord shares structural similarities with the human spinal cord. This protocol describes the generation of a reproducible murine model of spinal cord glioma by directly injecting tumor cells into the intervertebral space using the spinous process of the seventh cervical vertebra as a guide. Compared to other methods, this approach is more effective and convenient, involving a smaller incision, reduced invasiveness and blood loss, faster recovery, and more stable tumor formation. This model is expected to advance the understanding of disease mechanisms, optimize surgical strategies, and support the development of therapeutic drugs for spinal cord gliomas.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

The present protocol describes the development of a reproducible murine model of spinal cord glioma by injecting tumor cells into the intervertebral space, offering a more effective and less invasive approach for research and therapeutic development.

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

Spinal cord gliomas are commonly malignant tumors of the spinal cord, leading to a high rate of disability. However, uniform treatment guidelines and ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

免疫・感染学

Candida albicansバイオフィルム関連PJIのマウスモデルの確立

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and scientists. Generally, biofilms that can shield C. albicans from antibiotics and immune clearance are formed at the infection site. Surgery involving the removal of the infected implant, debridement, antimicrobial treatment, and reimplantation is the gold standard for the treatment of PJI. Thus, establishing animal PJI models is of great significance for the research and development of new drugs or therapeutics for PJI. In this study, a smooth nickel-titanium alloy wire, a widely used implant in orthopedic clinics, was inserted into the femoral joint of a C57BL/6 mouse before the C. albicans were inoculated into the articular cavity along the wire. After 14 days, mature and thick biofilms were observed on the surface of implants under a scanning electronic microscope (SEM). A significantly reduced bone trabecula was found in the H&amp;E staining of the infected joint specimens. To sum up, a mouse PJI model with the advantages of easy operation, high successful rate, high repeatability, and high clinical correlation was established. This is expected to be an important model for clinical studies of C. albicans biofilm-related PJI prevention.

著者スポットライト:カンジダ・アルビカンスのバイオフィルム関連補綴関節感染症に関する研究の進展 

Periprosthetic joint infection (PJI) caused by dangerous pathogens is common in clinical orthopedics. Existing animal models cannot accurately simulate the actual situation of PJI. Here, we established a Candida albicans biofilm-associated PJI mouse model to research and develop new therapeutics for PJI.

マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...

脊椎インプラント感染のin vivoマウスモデル

要約

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神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

合わせた

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

マウスにおける人工関節周囲カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおける人工関節周囲カンジダ・アルビカンス感染モデル

脊椎インプラント感染のin vivoマウスモデル

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

合わせた

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスの脊髄への腫瘍細胞の外科的移植

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

マウスにおける人工関節周囲カンジダ・アルビカンス感染モデル

マウスにおける人工関節周囲カンジダ・アルビカンス感染モデル