PLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョンを開発しました。ピッカリングエマルジョンは、抗原タンパク質細胞に対する細胞親和性を改善し、抗原の効率的なインターナリゼーションを誘導しました。ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョンは、抗原を効率的に調製および送達することが容易であった。
さらに、エマルジョンの細胞への親和性を監視し、内在化について詳しく説明する方法が使用されました。このプロトコルは、高い細胞効率と効率的な抗原インターナリゼーションを備えた新規製剤を設計するための洞察を提供し、効率的なワクチン開発のためのプラットフォームを提供します。はじめに、100ミリグラムのポリ乳酸 - コ - グリコール酸を10ミリリットルのアセトンとエタノールの混合物に4対1の比率で加えて油相として機能させる。
20ミリリットルのPVA水溶液をヒュームフードの下に置き、毎分400回転で磁気的に攪拌します。シリンジポンプを使用して、5ミリリットルの油相をPVA溶液に一滴ずつ加えます。次に、有機溶媒が完全に蒸発するまで、ヒュームフード内で混合物を攪拌します。
有機溶剤の揮発後、最終的な洗浄水が透明で透明になるまで、混合物を15, 000 Gで3回以上遠心分離します。洗浄したPLGAナノ粒子を2ミリリットルの脱イオン水に再懸濁し、混合物を摂氏80度で24時間凍結します。PLGAナノ粒子のサイズとゼータ電位を特徴付けるには、10マイクロリットルのPLGAナノ粒子を1ミリリットルの脱イオン水に加えて希釈液を得て、その希釈液をDTS1070セルに移します。
コンピューターと動的光散乱アナライザの電源を入れます。次に、DTS1070セルをDLSシステムに配置します。Zetasizerソフトウェアをクリックし、新しい測定ファイルを作成して決定手順を設定します。
次に決定手順を開始し、粒径およびゼータ電位分布を得る。PLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を調製するには、凍結乾燥PLGAナノ粒子を1ミリリットルあたり4ミリグラムの濃度で脱イオン水に加え、次に油相としてスクワランを加える。水浴超音波処理器で100ワットで5分間のワンステップ超音波処理を介してPNPEを準備します。
20マイクロリットルのPNPEと1ミリリットルの脱イオン水を希釈します。スライドに20マイクロリットルのエマルジョンを落とします。エマルションの形態と均質性を光学顕微鏡で40倍の倍率で観察し、写真を取得します。
電源ボタンを押してスピンコーターの電源を入れます。コントロールボタンを押して、コーティングの時間と速度を設定します。窒素パイプをスピンコーターに接続し、ガスボンベの分別を0.4キロパスカルに調整します。
きれいなチップをスピンコーターの吸盤に置きます。100マイクロリットルのポリ-l-リジンを二酸化ケイ素センサーの中央に滴下し、スピンコーターの上部カバーを閉じます。スタートボタンを押してサンプルのコーティングを開始し、終了したらマシンを停止します。
真空ポンプの電源を切り、電源ボタンと制御ボタンをオフにして、ポリ-L-リジン修飾二酸化ケイ素センサーを取り外します。PNPEへの生体模倣細胞外小胞の接着を確認するには、コンピューター、電子ユニット、および蠕動ポンプの電源を入れ、ソフトウェアの右下にある温度制御をアクティブにして、設定温度が室温より摂氏約1度低いことを確認します。操作手順に従ってポリ-l-リジン修飾二酸化ケイ素センサーをフローセルに配置し、フローセルとフローポンプの間に測定ラインを接続します。
フロー モジュール システム内にフロー セルを配置します。「集録」ツールバーをクリックし、「測定のセットアップ」を選択して、使用するチャンネル内のチップの1、3、5、7、9、および11オクターブを検索します。ベースラインを修正するには、[測定の開始]をクリックして、空気のベースラインが滑らかになるまで空気がフローモジュールに入るようにします。
脱イオン水を10〜15分間流して溶液のベースライン平衡を再び有効にした後、調製したPNPE溶液を毎分50マイクロリットルの流量でフローモジュールに送り込み、二酸化ケイ素センサーへの平衡吸着を達成します。調製した生体模倣細胞外小胞溶液を毎分50マイクロリットルの流量でフローモジュールにポンプで送り込み、PNPE表面へのbEV接着のプロセスを追跡します。骨髄樹状細胞を1640の完全な培地で7日間インキュベートし、摂氏37度で一晩1ウェルあたり10〜6回、小さな共焦点レーザー皿に播種し、5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。
0.5ミリリットルのシアニン5標識オボアルブミンを0.5ミリリットルのPNPEと1時間混合し、5, 000Gで20分間遠心分離して流体抗原を除去し、ワクチン製剤を開発します。200マイクロリットルの脱イオン水で再懸濁した後、10マイクロリットルの製剤をスーパークリーンベンチ下の小さな共焦点レーザーディッシュに加え、骨髄樹状細胞と6時間共培養します。細胞から培養液を取り出した後、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄する。
細胞を4%ホルムアルデヒド溶液とPBSで室温で10分間固定します。細胞をPBSで室温で2〜3回、それぞれ10分間洗浄します。100マイクロリットルの0.5%Triton X-100溶液で室温で5分間細胞を透過処理します。
細胞をPBSで再度洗浄した後、小型共焦点レーザー皿のガラス底皿上の細胞を200マイクロリットルのフルオレセインイソチオシアネート結合ファロイジン作業溶液で覆い、暗所で室温で30分間インキュベートします。細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄した後、核を200マイクロリットルのDAPI溶液で約30秒間再染色します。画像解析では、レーザー、共焦点、顕微鏡、コンピューターを含む共焦点顕微鏡ハードウェアを順番にオンにします。
ソフトウェアをクリックし、ニコン共焦点を選択してテストシステムに入ります。共焦点顕微鏡システムでは、記載されている順序でさまざまなユニットの電源を入れます。まず、FITC、DAPI、およびCy5チャネルを設定し、対応するHVとオフセットを調整します。
次に、100倍のオイルレンズを選択した後、染色された骨髄樹状細胞を含む小さな共焦点レーザー皿を顕微鏡ステージ上に置きます。スキャンボタンをクリックします。蛍光顕微鏡下で、x軸、y軸、z軸を動かして目的の細胞を見つけます。
レーザー強度、画像サイズ、その他のパラメータを調整して、高品質の共焦点画像をスキャンできるようにします。最後に、[キャプチャ]ボタンをクリックして画像を保存します。PNPEへの生体模倣細胞外小胞の接着をQCM-Dを用いて追跡した。
頻度の即時減少は、遭遇後のPNPEへの生体模倣細胞外小胞の急速な接着を示した。さらに、デルタFは、生体模倣細胞外小胞濃度の増加とともに減少し、濃度依存的な効果を反映している。PLGA微粒子と界面活性剤安定化ナノエマルジョンは、ミリリットルあたり80マイクログラムの高濃度でも生体模倣細胞外小胞に弱く結合しており、これはおそらく免疫細胞との接触部位の欠如に起因していた。
シアニン-5オボアルブミン蛍光シグナルは、PNPE処理群では、PLGA微粒子および界面活性剤安定化ナノエマルジョン処理群と比較して、細胞内に取り込まれた抗原の総量が有意に高いことを示しました。細胞取り込みの定量分析は、PLGA微粒子および界面活性剤安定化ナノエマルジョンで処理したものよりも、PNPEで処理した蛍光および骨髄樹状細胞の相対強度が有意に高いことを示した。得られた結果は、PNPEが抗原のインターナリゼーションを促進し、抗原を細胞内に効果的に送達することを実証した。
均質なエマルジョンを得るためには、超音波処理中に混合物を連続的に振盪しなければならない。
