このプロトコルは、癌転移分野における重要な質問に答えることを可能にした。腫瘍細胞が肺を植民地化する方法を含む?腫瘍細胞はどのように休眠状態に保たるのか?
そして、何が彼らが休眠状態を終了し、最終的に転移を形成するように誘導します。このプロトコルの主な利点は、動的転移プロセスが実際の微小環境で、リアルタイムで生体内で直接研究できることです。この方法は、いくつかの肺疾患に関する洞察を提供することができますが、転移の一般的な部位である肺に広がる個々の腫瘍細胞の行動を理解するのに特に有用です。
まず、2-0シルク縫合糸を使用して、22ゲージのカテーテルのベースで結び目を結び、2インチの長い尾を残します。マウスが完全に麻酔されたら、マウスを操作テーブルに移動し、マウスを挿管し、マウスのスナッテの周りに2-0シルク縫合糸を結ぶことによって挿管カテーテルを固定します。換気装置を挿管カテーテルに接続します。
紙テープを使用して、前面をクラニカルに固定し、後肢を加熱された外科段階に向けて突き止めます。マウスの背中の長さに紙テープを置き、外科分野への露出を最大化します。鉗子で皮膚を持ち上げ、胸骨に左に約7mm、肋骨下マージンより約7mm優れた約10mmの円形切開を行います。
肋骨の上に柔らかい組織を物品化します。鉗子を使用して6番目と7番目の肋骨を高めます。肺に向かって丸みを帯びた側を持つ鈍いマイクロ解剖ハサミの単一のブレードを使用して、胸部内空間に入るために6番目と7番目の肋骨の間の肋間筋を慎重に突き刺します。
欠陥時に圧縮空気キャニスターを繊細に排出し、肺を崩壊させ、肺を胸壁から分離した。肺の肺損傷を防ぐために、短いバーストで圧縮空気を発射します。切削工具の上に生検パンチを置き、肋間切開を通して切削工具のベースを慎重に操縦します。
切削工具のベースを胸壁と平行に向け、リブケージに5mmの円形の穴を開けます。5-Oシルク縫合糸を使用して、穴から約1mmの財布のひもステッチを円周に置きます。次に、窓枠を、窓溝内で取り込んだ円形の欠陥のエッジを持つ胸壁に配置します。
5-Oシルク縫合糸をしっかりと結び、埋め込まれた窓をしっかりとロックします。肺を乾燥させるために約10〜20秒間、圧縮空気の安定した穏やかな流れを適用します。鉗子を使用して窓枠を外側の端でつかみ、静かに持ち上げて、窓枠の下面から肺を分離させます。
光学窓枠の下面に沿ってシアノクリレート接着剤の薄い層を分配します。光窓枠を肺組織に10~20秒間しっかりと押し込み、取り付けます。長方形のカバースリップに5mmの接着剤を塗布します。
5 mm カバースリップを拾うために、真空ピックアップ ツールを使用します。カバースリップの下面を接着剤に浸し、余分な接着剤を長方形のカバースリップの側面に対して3回削り取り、カバースリップに非常に薄い接着剤の層を作ります。カバースリップは、肺組織のすぐ上にある光学窓枠の中央にある凹部内の角度に慎重に配置します。
人工呼吸器を短くクランプして陽圧を発生し、肺をハイパー膨張させる。回転運動を使用して、カバースリップを肺組織に平行に向けて、肺表面とカバースリップの下面との間に直接堆積を作成します。約25秒間穏やかな圧力を維持し、シアノアクリル酸接着剤をセットします。
真空ピックアップツールからカバースリップを鉗子で分離します。5-Oシルク縫合糸を使用して、皮膚切開の切り抜きエッジから1mm未満の周回に、財布のひもステッチを作成します。窓をロックノットでしっかりと結ぶ前に、窓枠の外縁の下に余分なスキンを押し込みます。
金属ガラスインターフェースで少量の接着剤を塗布し、カバースリップと窓枠の間に密閉シールを確保します。1 ml のインシュリンシリン注射器に滅菌針を取り付けます。針をxiphoidプロセスの下に挿入し、左肩に向かって進み、横隔膜を通って胸腔に入ります。
シリンジをそっと引き戻し、胸腔から残った空気を取り除きます。単一の肺領域の多光子の生体内画像化は、微小血管が3日間にわたって連続して移動できることを示した。単一の容器からの定義可能な分岐点は、連続した日ごとに同定された。
ラベルのない赤血球は、より大きな血管を流れるときに影を作り出した。船舶に対する分岐点の角度を使用して、赤血球流量を計算することができます。赤血球速度も蛍光微小球をマウスに注入して定量化し、それらのトラック長をフレーム取得時間で割って測定した。
静止した微小球は区別可能であった。播種された腫瘍細胞の運命は、肺の高解像度イメージングのために窓を使用して、数日間にわたって連続イメージングで追跡された。腫瘍細胞は1日目に肺血管系に到着し、宿宿した。
しかし、2日目と3日目に肺血管構造で細胞が検出されず、再循環または飛び出しを示した。肺の転移性進行の最高潮ステップは、腫瘍細胞の到着、肺のパレンチマへの腫瘍細胞の飛散および増殖から始まり、マクロ転移を形成するように視覚化された。光学式ウィンドウフレームの配置中に肺に外傷を避けるように注意してください。
肺は出血しやすいので、後で配置中にカバースリップの付着を妨げる。この手順に従って行うことができる他の方法は、マイクロカートグラフィーへの変更されたアプローチで採用された場合、繰り返しイメージングのための関心領域の正確な再局在化を可能にする生体内顕微鏡検査を含む。このプロトコルは、転移のメカニズムに関する重要な質問の調査で肺の可視化を可能にした。
この研究は、がん患者のための新しい治療法を再構築する可能性を運びます。
