このプロトコルは、精子の能力の中でエネルギー代謝の変化を監視するために細胞外フラックス分析装置を適用するために使用することができます。このプロトコルは、非容量化マウス精子とキャパシタントマウス精子の間で、解糖と酸化リン酸化の変化をリアルタイムで比較するプロトコルを開発しました。アッセイの前日に、センサーカートリッジを細胞外フラックスアッセイキットから取り出し、ユーティリティプレートの横にカートリッジを逆さまにします。
25ミリリットルの二重蒸留水で溶液貯留槽を満たし、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルの水を加え、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。プレートを37°Cの非二酸化炭素インキュベーターに入れる。次に、アリコート25ミリリットルの細胞外フラックス分析装置キャリブラントを50ミリリットルの円錐管に入れ、37°Cの非二酸化炭素インキュベーターにチューブを入れる。
ConAコーティングされたマイクロプレートを調製するには、2.5ミリグラムのConAを5ミリリットルの二重蒸留水に溶解し、マルチチャネルピペットを使用して、細胞外フラックスアナライザー96ウェルプレートの各ウェルをConA溶液の50マイクロリットルで満たし、蓋を開けてプレートを一晩乾燥させます。精子バッファーを準備するには、細胞外フラックス分析計TYHバッファーの 250 ミリリットルを摂氏 37 度に加熱し、pH を 7.4 に調整します。アッセイの日に、ユーティリティプレートの各ウェルの水をウェルあたり200マイクロリットルのXFキャリブラントに交換し、プレートを少なくとも1時間非二酸化炭素インキュベーターに戻します。
ウェーブテンプレートを生成するには、細胞外フラックスアナライザをオンにします。温度が摂氏37度に安定している間、波のソフトウェアを開き、空白のテンプレートを開きます。グループ定義タブで、アッセイ媒体をTYHと定義し、細胞タイプをマウス精子として定義し、注射戦略と前処理は空白のままにします。
アッセイ条件ごとに異なるグループを作成し、プレートマップを開いて各グループを特定のウェルに割り当てます。プロトコルタブで、平衡化を解除し、4つの異なる測定サイクルをそれぞれ追加し、それぞれのポートを選択して測定の詳細を編集して、射出後の測定が強調表示されるようにし、アッセイテンプレートを保存し、プロジェクトの概要を記入して結果を保存します。精子を収穫する前に、摂氏37度でTYHバッファーの50ミリリットルを前温くする。
成体雄マウスからカウダを収穫した後、各カウダを24ウェルプレートの個々のウェルに事前に温めたTYHバッファーの500マイクロリットルに入れます。鉗子を使用して各コーダを各ウェルの底に個別に固定化し、羽のはさみを使用して各組織に5〜7回の小さな切開を素早く作ります。すべてのカウダが切開されたら、すぐにプレートを非二酸化炭素インキュベーターに入れ、精子が15分間分散できるようにします。
センサーカートリッジをロードするには、センサーカートリッジから蓋を取り外し、それぞれのポートローディングガイドの文字をカートリッジの左上隅に合わせます。ポートローディングガイドを所定の位置に保持し、ピペットチップをポートAのポートローディングガイドホールに垂直に挿入し、20マイクロリットルのTYHバッファを各カラムに注入します。ポートBの場合、22マイクロリットルのTYHバッファーを列1から4に、22マイクロリットルの5〜8列に22マイクロリットルの5ミリモル2-デオキシグルコースを注入し、5マイクロモルアンチマイシンAロテノンの25マイクロリットルを9〜12の列に注入します。
ポートCの場合、奇数と25マイクロリットルのジブトリリリ環式AMP 500マイクロモルIBMXを偶数数ですべてのカラムに25マイクロリットルの異数のタイフバッファを各カラムに注入し、キャリブレーションプレートを備えたセンサーカートリッジを細胞外フラックス分析装置に入れて測定を開始します。キャリブレーションには10~15分かかります。精子プレートを準備するには、TYHバッファーに1ミリリットルのウシ血清アルブミンあたり3ミリグラムの3ミリリットルを3つの5ミリリットル遠心分離管のそれぞれに加えます。
次に、3つの1.5ミリリットル遠心分離管のそれぞれに精子の2つの井戸をプールします。カウント後、ウシ血清アルブミンを補充した新鮮なTYHで、サンプル当たりの1ミリリットル濃度当たりの精子を2倍10倍に希釈する。遠心分離によって精子を沈下し、TYHバッファーの1ミリリットルで精子ペレットを再中断する。
再び精子を遠心分離し、ペレットを乱さないので注意して上清を取り除きます。各精子懸濁液を調製した5つのミリリットル遠心分離管の1つに移し、180マイクロリットルのTYHバッファーをConAコーティングされたプレートの各コーナーウェルに加えます。ConAコーティングされたプレートの各空き井戸に180マイクロリットルの精子を加え、遠心分離の間にプレートを180度回転させるプレートを遠心分離し、精子プレートでキャリブレーションプレートを配置し、アッセイを継続します。
本代表的な実験では、精子を、薬理学的モジュレーターとして、エネルギー基質と2-デオキシグルコースと抗マイシンおよびロテノーンのみのエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量を調整した。矢印は、カパシフィテーションの誘導を示します。グルコースの存在下で、2-デオキシグルコースによる解糖を遮断することによって阻害される細胞外酸性化率の7倍の増加を伴う能力増強を伴った。
容量化精子は、マウス精子が解糖と酸化リン酸化の両方を増強し、能力増強中のエネルギー需要の増加を支えることを実証する非キャパシタ化精子と比較して、酸素消費率の20倍の増加を実証した。精子の能力増強中の細胞外酸性化率の上昇は、この速度の変化が主に解糖からの水素放出によって駆動されることを示す酸化リン酸化阻害剤であるアンチマイシンAおよびロテノーネの影響を受けない。しかし、酸素消費率の増加は、抗マイシンAとロテノン、ならびに2-デオキシグルコースによってブロックされ、精子の能力増強中のOXPHOSの増加は解糖活性に依存することを明らかにする。
エネルギー源および薬理活性剤および阻害剤は、実験の目的に応じて変化させることができ、最大12の異なる条件を並行して測定することができる。プロトコルは、カパチリエーション中のエネルギー代謝の変化が同様に謎めいた人間やウシのような他の種に簡単に適応することができます。
