これらの手順の目的は、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー分析と組み合わせた特定の蛍光プローブを使用して、精子膜の完全性を評価することです。これらの技術は、受精の可能性の予測や精子サンプルの質など、生殖の分野で重要な質問に答えるのに役立つかもしれません。これらの技術の主な利点は、精子受精電能と関連付けられる複数の精子膜の正確な評価を可能にすることです。
これらの技術の意味は、精子の血漿とアクロソーム膜の完全性だけでなく、ミトコンドリア膜の可能性のより正確な評価を可能にするので、射精品質の診断にまで及ぶ。この手順を開始するには、室温で15ミリリットルチューブ内の約1〜6ミリリットルの雄牛精液を得る。精液の各1ミリリットルに摂氏37度に事前に温めたNKMバッファーの6ミリリットルを追加します。
8分間600回gで遠心分離機。上清がはっきりするまで遠心分離を1、2回繰り返します。この後、すぐに上清の大部分を捨て、ペレットの上に約1センチの上清を残します。
慎重にインキュベーターで30度の角度でチューブを傾け、精子が泳がれるように20〜30分待ちます。マイクロピペットを使用して、残りの1ミリリットルの上清を慎重に除去し、現在はモタイル精子を含み、新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。精子を37°Cで使用する準備ができるまで保ちます。
まず、テキストプロトコルで概説されているように、必要なすべてのストックソリューションを準備します。次に、1ミリリットル当たり2500万個の精子の濃度で133マイクロリットルの運動精子を新しい1.5ミリリットルチューブに移す。DAPI作業溶液を17マイクロリットル加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。
遠心分離機を1,000倍gで5分間行う。上清を捨て、ペレットに100マイクロリットルのNKMバッファーを加えます。次に、FITC-PSAの50マイクロリットル、JC-1の2マイクロリットル、および3マイクロリットルのPIを加えます。摂氏37度で10分間インキュベートします。
遠心分離機を1,000倍gで5分間行う。上清を捨て、40マイクロリットルのNKMバッファーにペレットを再懸濁します。その後、サンプル10マイクロリットルをガラススライドに移します。
サンプルを塗り、カバースリップを追加します。この後、テキストプロトコルで概説されている40X目的とトリプルフィルターを用いて、すぐに蛍光顕微鏡によるサンプルの可視化を開始し、デジタルカメラを使用して各フィルタの別々の画像をキャプチャします。カメラソフトウェアのマージオプションを使用して、フィルタから受信した3つの画像をマージし、新しいファイルをJPEG形式で保存します。
ペイントツールでマージされた画像を開き、ブラシオプションを使用して、カウントされた精子をマークします。次に、各プローブから放出される蛍光に基づいて精子を分類し、スライド当たり少なくとも200個の精子を評価することを確認する。DAPI からすべてのセルが青色で表示されます。
生存率を評価するために、紫色に見える死んだ細胞を数えます。次に、蛍光染色のパターンを用いて、アクロソーム状態を評価する。最後に、緑色に染まった中間片を示すミトコンドリア膜電位が低い精子から赤染色された中間体を示す高いミトコンドリア膜電位を有する精子を区別することにより、ミトコンドリア膜電位を評価する。
赤と緑のミッドピースを別々にカウントし、その比率を計算します。原形質膜完全性評価を開始するには、生存率および濃度キットから所望の数のウェルを取ります。井戸を作業ベースに移し、柔軟な蓋で覆い、光から保護します。
各ウェルにサイトメトリー用の緩衝溶液199マイクロリットルを加えます。その後、各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で均質精液の1マイクロリットルを追加し、ピペット処理によって均質化する。蓋でプレートを覆い、摂氏37度で10分間インキュベートします。
この後、生存率設定を使用してフローサイトメーターを通してサンプルを実行します。ミトコンドリア膜電位の評価を開始するには、ミトコンドリア活性キットから所望の数のウェルを取り出す。作業ベースに転送します。
各ウェルに10マイクロリットルの絶対エタノールを加え、ピペットを使用してウェル内に存在する粉末を再懸濁させます。1ウェルあたり190マイクロリットルのPBSを加え、ピペットで均質化します。各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で0.75マイクロリットルの均質精液を加え、ピペット処理で均質化します。
蓋でプレートを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。この後、ミトコンドリア活性設定を使用して、フローサイトメーターを通してサンプルを実行します。アクロスソーム膜の完全性の評価を開始するには、生存率および不死性完全性キットから所望の数のウェルを取り出します。
井戸を作業ベースに移し、柔軟な蓋で覆い、光から保護します。各ウェルにサイトメトリー用の緩衝溶液200マイクロリットルを加えます。その後、各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で0.7マイクロリットルの均質精液を加え、ピペット処理によって均質化します。
蓋でプレートを覆い、摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、インサイト設定を使用して、フローサイトメーターを通してサンプルを実行します。本研究では、精液の質は異なる技術を用いて評価され、そのうちの1つはフルオロメトリックプローブを用いて精子膜を評価した。
精子サンプルの質の違いを膜の完全性の観点から評価することが可能である。例えば、7番の雄牛の射精は、死んだ細胞の割合が比較的低く、疑似反応したアクロソームを有する精子の割合が低く、かつ、雄牛ナンバーワンの射精と比較するとミトコンドリア膜電位が高かった。次いで、サンプルの生存率とミトコンドリア活性について評価されます。
これらの代表的な例のヒストグラムは、アンガウンド精子および破片およびゲート付き精子を表す。これらのヒストグラムはまた、生存細胞と死細胞および分極および脱分極ミトコンドリア膜への精子の分布を表す。その後、アクロソームの完全性をすぐに使用できるキットで評価し、フローサイトメトリーで読み取り、無傷の未染色のアクロソーム、残存性の染色部分を持つ低蛍光細胞、および破壊されたワニ体を有する高い蛍光細胞を有する3つのマーカー領域に分割する。
これらの手順を試みている間、 最初の精子サンプルを適切に準備することが重要です。これらの技術は、精子の質評価に関する洞察を提供し、ウシ、家禽、および人間などの様々な生物に適用することができます。4倍の染色とフローサイトメトリーの2つの技術の比較は、生存率、ミトコンドリア膜電位、および2つの技術が一致する結果を生み出すことを明らかにするアクロソーム完全性について有意な差を示さなかった。
