このプロトコルは、組換えロタウイルスを作るための信頼性の高い効率的な逆遺伝学システムを記述する。また、蛍光マーカータンパク質を発現する組換えロタウイルスの作り方についても説明します。この方法は、最小限の数のプラスミドを必要とする単純であり、別々のフッ素タンパク質だけでなく、ウイルスタンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成することができます。
BHKT7細胞を12ウェルプレートに播種し始めます。細胞の新鮮なコンフルエント単層をPBSでリンスします。次に、トリプシン-EDTA溶液で単層を破壊し、GMEM完全培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。
トリパンブルーと自動セルカウンターを使用して、生存可能なBHKT7細胞の濃度を決定します。その後、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルにGMEMの1ミリリットルで5番目の細胞に2回10回播種する。一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cでプレートをインキュベートします。
翌日、原稿の指示に従ってトランスフェクション用のプラスミド混合物を準備します。その後、各プラスミド混合物に110マイクロリットルの事前温め込み減らされた血清培地を加え、ピペットを上下に軽く加え、混合します。32マイクロリットルのトランスフェクション試薬を混合物に加える。
ボルテックスに続いて短い遠心分離を行い、室温で20分間インキュベートします。一方、GMEM不完全培地の2ミリリットルでBHKT7細胞をすすいでください。各ウェルにSMEM不完全培地を1ミリリットル加え、プレートをインキュベーターに戻します。
20分間のインキュベーションの後、200マイクロリットルのピペットを使用して、トランスフェクション混合物を各ウェルに滴下して添加します。そっとプレートを揺らし、インキュベーターに戻します。トランスフェクションの2日後、MA104細胞の新鮮なコンフルエント単層をPBSでリンスする。
トリプシン-EDTA溶液で単層を破壊し、DMEM完全培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を数え、DMEM不完全培地のミリリットル当たり5番目の細胞に8倍10倍に濃度を調整します。トランスフェクトされたBHKT7細胞を持つウェルに滴下するMA104細胞の0.25ミリリットルを追加します。
各ウェルに1ミリリットルトリプシンストック溶液あたり1ミリグラムに0.8マイクロリットルを追加することにより、トリプシンの濃度を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムに調整します。残りのMA104細胞をDMEM完全培地中のミリリットル当たり1.5倍の10倍の濃度に希釈し、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを入れる。トランスフェクションの6日後、トランスフェクトされた細胞から組換えウイルスを回収する。
BHKT7 MA104細胞を無菌条件下で3サイクルの凍結/解凍を行い、プレートをマイナス20°Cの冷凍庫と室温の間で移動させる。1.5ミリリットルのチューブにライセートを移す。500倍gで10分間チューブを遠心分離し、セルラーデブリをペレットに摂氏4度。
上清を集め、摂氏4度で保存します。1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度に100マイクロリットルの明確な細胞ライセートにトリプシンを加え、1時間摂氏37度で混合物をインキュベートします。次に、DMEM不完全培地で10からマイナス1から10からマイナス7までの10倍のシリアル希釈シリーズを準備します。
MA104単層を2ミリリットルのPBSで2回、DMEM不完全培地で1回リンスします。400マイクロリットルのライセート希釈液をプレートに加え、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、10~15分ごとに揺れ、単層全体に希釈液を再分配します。1.5%溶融し、冷却アガロースと事前に温めた2X EMEMの等しい量を組み合わせることによってアガロースMEMオーバーレイソリューションを準備します。
水浴中の摂氏42度で溶液を維持し、細胞上に置く前に、トリプシン濃度を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムに調整します。6ウェルプレートからの吸気溶離希釈液。その後、不完全な培地の2ミリリットルで細胞を一度すすい。
アガロースMEMオーバーレイ溶液の3ミリリットルを各ウェルの細胞単層にそっと加えます。アガロースを室温で硬化させます。その後、プレートをインキュベーターに戻します。
3日後、先に説明したようにアガロースMEMオーバーレイ溶液を調製し、使用直前にミリリットル当たり50マイクログラムの最終濃度に中性赤色を加える。6ウェルプレートの既存のアガロースの上に2ミリリットルのオーバーレイ溶液を追加します。アガロースを硬化させ、プレートをインキュベーターに戻し、中性の赤でプレートを光から保護します。
次の6時間にわたって、ライトボックスの助けを借りてロタウイルスプラークを識別します。使い捨て可能な移写ピペットを使用して明確に定義されたプラークを選び、細胞層に完全に伸びるアガロースプラグを回収する。0.5ミリリットルのDMEM不完全培地を含む1.5ミリリットルのチューブにプラグを抜き、サンプルを30秒間渦に入れます。
MMEM不完全培地およびトリプシン1ミリリットル当たり0.5マイクログラムのMA104単層またはAT25フラスコで伝播することにより、培地中に溶出したプラーク分離ウイルスを増幅する。600マイクロリットルの透明化された感染細胞ライセートと400マイクロリットルのグアニジニウム・チオシアネートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加えます。30秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。
その後、クロロホルムの200マイクロリットルを追加します。溶液を30秒間ボルテックスし、3分間インキュベートする。13,000グラムと摂氏4度で5分間のマイクロセントリフィケーションを行った後、上水相の550マイクロリットルを新鮮なチューブに移します。
冷たいイソプロピルアルコールの2つのボリュームを追加し、チューブを4〜6回反転します。室温で10分間インキュベートします。その後、13,000倍gと摂氏4度で10分間遠心分離します。
RNAペレットを残して上澄み物を捨てます。1回反転させ、700g、摂氏4度で5分間遠心分離して、75%エタノールの1ミリリットルをチューブに加えてRNAを洗浄します。エタノールを慎重に除去した後、RNAを5〜10分間空気乾燥させます。
その後、ペレットを15マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解する。溶存RNAサンプルの10マイクロリットルに6X DNAローディングバッファーの2マイクロリットルを追加します。プレキャスト10%ポリアクリルアミドミニゲルにロードします。
トリスグリシンランニングバッファ内の電気泳動で、一定の16ミリアンペア電流で2時間RNAを解決します。ゲルの実行が完了したら、ゲルを1ミリリットルのエチジウム臭化エチジウムを含む水に5〜10分間浸し、UVトランスイルミエーターでロタウイルスゲノムセグメントを検出します。この逆遺伝学プロトコルは、組換えSA11ウイルスを生成するために使用され、これは、プラークの単離を可能にするMA104細胞上のプラークアッセイで容易に同定することができる。
プラーク精製されたrSA11野生型およびSA11-UnaGウイルスのdsRNAゲノムを、フェノールおよびグアニジニウム・チオシアネートを含む溶液で抽出し、10%ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によって分解し、臭化エチジウムで染色することによって検出した。予想通り、rSA11-UnaGのセグメント7またはNSP3 dsRNAは、2A-3xFLUnaG配列の存在により、rSA11野生型よりもはるかに遅く移行した。UNaG蛍光タンパク質の発現を確認するために、MA104細胞を野生型および組換えウイルスに感染させ、生細胞画像で検査した。
分析の結果、rSA11-UnaGは緑色蛍光を生み出し、rSA11野生型に感染した細胞では蛍光は検出されなかった。免疫ブロット分析を行い、2A要素のrSA11-NSP3-2A-xflUnaGが2つの別々のタンパク質の発現を促進したかどうかを調べた。分析の結果、NSP3-2Aおよび3xFL-UnaGは、実際に機能的2A元素を示す別々のタンパク質として発現していた。
組換えロタウイルスの回復を成功させるためには、トランスフェクション用の品質、よく維持されたBHKT7細胞、過剰播種用MA104細胞、および正確な量の高純度プラスミドを使用することが重要です。このプロトコルは、逆遺伝学系を使用してロタウイルスNSP3遺伝子を改変する方法を説明しますが、SP1などの他の遺伝子を改変するためにも同じアプローチを使用できます。
