本研究では、イアン·グッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給し、マリーキュリーイントラヨーロッパのフェローシップ（FP7欧州研究評議会）は、アルマンド·アリアスに授与されました。私達は私達に彼らのAgilentのbioanalyserを使用する許可を与え、RNAサンプルを実行すると助けるためにイオ香港チョン博士レベッカロービーとDrマイクスキナーに感謝します。

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. 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Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. 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M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. 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Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、細胞培養における感染MNVの回復を可能にする2つの異なった逆遺伝学的アプローチを説明しました。両方を効果的に近づくし、細胞リボソームによって認識されるキャップMNVの転写産物の生成を介したウイルスRNAゲノムの5 &#39;末端にVPGの共有結合のための絶対的な要件をバイパスします。in vitro転写酵素キャッピング続いて、より効率的です。転写物はFPVキャッピング酵素によってキャップされるかもしれないT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞に感染するプラスミドの転写より感染MNVの回復。これらの逆遺伝学システムで回収し、ウイルス力価は、感染した細胞培養液17（ 図5）から精製したウイルスVPG-結合型RNAのトランスフェクションによって得られたこれらに類似しています。寛容なRAW264.7細胞に覆われたMNV RNAのトランスフェクションは、transfectioを含む実験より1つだけログ低いウイルス力価をレンダリングn個のウイルスVPG-結合型RNA（ 図5）を含む感染細胞からのトータルRNA。この事実は、これらのシステムによって生成された転写産物の5 &#39;末端にVPG分子の添加はVPGに関連付けられている細胞にMNV感染性の根底にある機能的側面を明らかにすることが増加したウイルスの収率につながるかどうかを判断するためにさらなる調査を奨励しています。他のRNAウイルスに匹敵する高効率のいずれかの遺伝システムは現在、in vitro転写RNA のウイルス粒子19、20と実際の感染症に比べて唯一の10から100まで低価の回復を可能にするに使用される逆にそれにもかかわらず、我々は、このリバースジェネティクス系を考えています。 全体として、現在の方法論は、ノロウイルスの分子生物学の分野で大きな前進を構成し、ノロウイルスのゲノム中のタンパク質と保存されたRNAモチーフの機能的役割を調べるためのツールを提供してくれる。これらのアプローチは、既にCと組み合わされています10日未満4、21 -マウスurrentマウスモデル使用可能で、MNVが感染性cDNAから回収されたことが示されているが&gt; 80％STAT1-/の致死的感染を引き起こすことができます。我々はキャプシドタンパク質のおよび in vivo 21、22 でやや減衰の表現型を示すさまざまな宿主因子（PTBとPCBP）の結合に関与するポリピリミジン管の生存マウスノロウイルスの変異体を回復したこのシステムを活用した。さらに、我々は最近、ORF4からVF1タンパク質を発現する能力を欠いているウイルスが効率的に細胞培養で複製が再びWT MNV 8に対してマウスにおける病原性が低下していることを明らかにした。これらの研究は、私たちは潜在的なワクチン候補として検討することができMNVの研究に基づいて人間のノロウイルスの弱毒化のバージョンを設計することをお勧めします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>塩化リチウム沈殿ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA·ストレージ·ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7スクリプト</td><td> Ambionの</td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7Gキャッピングシステム</td><td> EPICENTREバイオテクノロジー</td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクション·システム·キット</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td>のOpti-MEM I </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985070 </td></tr><tr><td>リポフェクトアミン2000トランスフェクション試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td>アジレント·RNA 600ナノキット</td><td>アジレント</td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100バイオアナライザの双方向oanalyzer </td><td>アジレント</td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNAとジェルバンド精製キット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX大規模RNA生産システム-T7 </td><td>プロメガ</td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

人間のノロウイルスはヒトの胃腸炎（GE）は、世界中のほとんどの責任があると近い人から人への接触が1、2を回避することはできません環境での再発問題である。ここ数年の間に病院内で感染の発生率の増加は、その運用能力だけでなく、大規模な経済的損失に大きな混乱を引き起こして、報告されている。新たな抗ウイルスアプローチの識別は、細胞培養3で生産的な感染症を完了するには、人間のノロウイルスの無力のために限られていました。密接に人間のノロウイルス4に関連したマウスノロウイルス（MNV）、最近の分離がどのセル5に伝播することができますが、これらの病原体6,7の調査のための新しい道を開いた。 新しい正のセンスゲノムおよびサブゲノムRNA分子の合成MNVの複製の結果は、後者の最後のTHIに対応ウイルスゲノムのRD（ 図1）。 MNVは、ORF1は、ゲノムの大部分を占有し、ポリプロテイン前駆体から放出される7つの非構造タンパク質（NS1-7）をコードする4つの異なるオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれています。 ORF2とORF3はサブゲノムRNA領域内に含まれており、キャプシドタンパク質（それぞれVP1およびVP2）（ 図1）エンコードされています。最近、我々はORF2が重複し、追加ORF4を同定したが、別のリーディングフレームで機能的であり、ミトコンドリアのローカライズされた病原性因子（VF1）8にエンコードしています。 ノロウイルスを含む正センスRNAウイルス、の複製は、新しい上限​​なしRNAゲノムの合成で得られる細胞質内で行われます。ウイルスの翻訳を促進するために、ウイルスが細胞のタンパク質合成機械9-11募集を目的としたさまざまな戦略を利用する。興味深いことに、ノロウイルスの変換は多機能ウイルスのタンパク質プライマーVPGによって駆動され共有ゲノムおよびサブゲノムRNAを12から14の両方の5 &#39;末端にリンクされています。翻訳のこの洗練されたメカニズムは、従来の逆遺伝学的アプローチによるウイルス回収の限られた効率の主要な要因となる可能性があります。 ここでは、5 &#39;末端にキャップされたマウスノロウイルス-1（同封MNVと呼ばれる）の転写産物の生成に基づいて2つの異なる戦略を報告します。 2番目のアプローチは、T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞のcDNA MNVの転写を伴うのに対し、いずれかの方法では、in vitroでの合成およびウイルスRNAのキャップの両方が含まれます。 MNVと小動物モデルの研究のためのこれらの逆遺伝学·システムの可用性は、レプリケーションと病因15から17にウイルス配列の役割を分析するための前例のない能力を提供しています。

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

ノロウイルスは胃腸炎の主要原因である、まだそれらの特性評価のための分子技術はまだ比較的新しいです。ここでは、マウスノロウイルス（MNV）、細胞培養で増殖させることができるこの属の唯一のメンバーを効率的に回収するための2つの異なる逆遺伝学のアプローチを報告します。

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K ビュー.  Imperial College London. ノロウイルスは胃腸炎の主要原因である、まだそれらの特性評価のための分子技術はまだ比較的新しいです。ここでは、マウスノロウイルス（MNV）、細胞培養で増殖させることができるこの属の唯一のメンバーを効率的に回収するための2つの異なる逆遺伝学のアプローチを報告します。