RNAには100以上の明確な改変があり、その3分の2はメチル化です。このプロトコルはRNAメチル化ライター活性の敏感で正確な分析のための方法を提供する。この使いやすい技術により、一般的に人工物を起こしやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化し、視覚化することができます。
手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるサマンサ・シェルトンです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、氷上の1.5ミリリットルチューブに100マイクロリットルRNAメチルトランスビ転移酵素アッセイを設定します。チューブを完全に混合し、遠心分離機を200回gで5秒間ボルテックスし、チューブ下部の溶液を回収する。
2時間摂氏37度でチューブをインキュベートします。次に、テキストプロトコルで概説されているように、カラム精製を用いて反応を浄化する。液体シンチレーションカウントを実行するには、サンプルごとに1つのバイアル、バックグラウンド測定用のバイアル、スワイプテスト用のバイアル1個でシンチレーションカウントラックを設定します。
5ミリリットルのシンチレーションカウント溶液でバイアルを充填します。溶出した放射性RNAサンプル10マイクロリットルを1つのバイアルに加えます。蓋を締め、やさしく混ぜます。
スワイプテストバイアルを準備するには、手順中に使用されるすべての表面と機器に綿棒を徹底的にこすります。これらの綿棒をシンチレーション溶液で満たしたバイアルに加え、蓋を締めます。シンチレーションカウンターでサンプルを実行するには、カウンターフードを開き、ラックを機械に挿入し、フードを閉じます。
[単一ラックをカウント] を選択します。[ユーザー プログラムの選択] を選択します。60 秒間トリチウムを測定するプログラムを選択または作成し、カウント ラックをヒットします。
シンチレーションカウントを3回繰り返します。この後、テキストプロトコルで概説されているように、尿素変性ポリアクリルアミドゲルを調製し、再実行する。20マイクロリットルの20マイクロリットルの2Xゲルローディングバッファーを含む新しい1.5ミリリットルチューブに放射性RNA材料の20マイクロリットルを移します。
ラダーを準備した後、15分間摂氏70度でサンプルをインキュベートします。ゲルタンクからゲルのウェルにバッファーをピペット処理して、サンプルローディングの直前にゲルのウェルをもう一度洗います。次いで、調製されたラダーの20マイクロリットル、サンプルの20マイクロリットル、および20マイクロリットルの1Xゲルローディングバッファーをゲルのレーンにロードする。
ポリアクリルアミドの割合に応じて、ゲルを100ボルトで60〜180分間実行します。ゲルの実行が完了したら、カセットからゲルを取り出し、5マイクロリットルの超高感度核酸ゲル染色を含む1X TBEバッファーの50ミリリットルを含む箱に入れます。ロッカーに5分間インキュベートしてRNAを染色します。
この後、慎重に箱からゲルを取り出し、ウェルを上げ、左にはしごを持つゲルイメージングシステムのUVトランイルミニューエーターに置きます。カメラをゲルに合わせ、UV光を点灯し、ゲルの画像を撮ります。次に、UV 露出をオフにして、TIFF ファイルとしてイメージを保存します。
ゲルを箱に戻し、TBEを取り出し、室温で50ミリリットルの固定溶液でゲルを固定します。次に、自動ラジオグラフィー増強溶液の25ミリリットルを含む新鮮なブラックボックスにゲルを静かに移動させます。室温でロッカーに30分間インキュベートします。
ゲルをそっと持ち上げ、ウェルを上にしてはしごを右側に置いたラップのシートにうつ伏せに置きます。2枚のクロマトグラフィー用紙をゲルの裏面に置き、スタック全体を反転します。ゲルドライヤーを摂氏80度に予熱します。
ゲルドライヤーのプラスチックカバーを戻します。プラスチックカバーの下にスタック全体を挿入し、プラスチックカバーを下に戻してシールを作成します。ゲルを摂氏80度で1時間乾燥させます。
次に、ゲル乾燥機をオフにし、スタックをそっと取り出します。ラップと2つめのクロマトグラフィー用紙を取り除きます。残りのクロマトグラフィー紙を乾燥したゲルでオートラジオグラムカセットにテープで貼ります。
暗い部屋で、オートラジオグラフィーフィルムの1枚を追加します。カセットをマイナス80°Cで保存し、信号強度に応じて適時にフィルムを開発します。フィルムが開発されたら、カセットの上に置き、ラボマーカーを使用してゲルの4つのエッジ、各ウェル、およびXCとBB染料の位置を注意深くマークします。
フィルムを 300 ピクセルまたは 600 ピクセル/インチの解像度でスキャンし、TIFF ファイルとして画像を保存します。本研究では、RNAメチルトランスビサイアーゼ活性を解析するための抗体を含まないアッセイが実証された。7SK小核RNAのT7 RNAポリメラーゼとのインビトロ転写反応からの典型的なランは、比較的短く、高度に構造化されたRNAを示す。
ランダムな転写開始または終了イベントに起因する可能性が高い、7SKよりも短く、長い、複数の望ましくないバンドがあります。このため、インビトロ転写反応に続くゲル精製は、クリーンなRNAサンプルを得ることが重要である。この時点で、目的のRNAは、ラダーに対するその位置によって同定され、ゲル精製によって精製される。
推奨されるRNAおよびタンパク質濃度の下限を用いた代表的なRNAメチルトランスファー酵素アッセイをここに示す。このアッセイは、シンチレーションカウントからの定量的な結果と、オートラジオグラムからの定性的な結果の両方を可能にする。ここで、メチル化7SKに知られているRNAメチルトランスファーーゼは、U6のメチル化も可能であることが示されている。また、最近7SKについて示されるように、MePCEへのヒストンH4の結合もU6メチル化を阻害する。
これは、シンチレーションカウントとオートラジオグラムの両方で観察することができ、このプロトコルの堅牢性を示す。RNAは劣化しやすいので、RNaseフリー試薬を使用し、すべての表面や機器を徹底的に洗浄してください。このメチルトランスファーアーゼアッセイから得られた放射性標識RNAは、例えば電気泳動移動シフトアッセイによるRNAデメチル酵素活性またはRNA結合活性を直接評価するために使用することができる。
この方法により、研究者は、点突然変異および小分子阻害剤治療を含むRNAメチルトランスビナーゼ活性に対する異なる因子の効果をテストすることができます。この方法では放射性物質を使用するため、適切なPPEを着用し、放射性物質の取り扱いや処分には注意が必要です。
