Name: methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da uno stipendio di dottorato IMPRS a E.S, una borsa di studio a lungo termine EMBO per V.P., e fondi interni MPI-MPP a F.K. Parte di questo lavoro è stato finanziato anche attraverso PLAMORF, un progetto che ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (accordo di sovvenzione n. 810131). Gli autori ringraziano Federico Apelt per l'analisi bioinformatica e i commenti sul manoscritto, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi per l'analisi bioinformatica.

1. Preparare l'RNA
<ol><li>Macinare 200 mg di tessuto vegetale in polvere in azoto liquido, assicurandosi che il tessuto rimanga congelato durante tutta la procedura.</li>
	<li>Estrarre l'RNA dal tessuto vegetale desiderato seguendo un protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio. Per ridurre la possibilità di contaminare l'RNA con il DNA durante la separazione di fase, utilizzare 1-bromo-3-cloropropano invece del cloroformio.<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA contenente tiocianato di guanidina e fenolo acido al tessuto vegetale macinato (500 μL per 100 mg di tessuto). Mescolare bene invertendo e assicurarsi che tutto il tessuto sia bagnato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per dissociare i complessi di ribonucleoproteina.</li>
		<li>Centrifugare per 10 min a 12.000 x g a 4 °C e trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere vigorosamente 200 μL di 1-bromo-3-cloropropano (100 μL per 500 μL di reagente di estrazione dell'RNA) e vortice.</li>
		<li>Centrifugare per 15 min a 12.000 x g a 4 °C e trasferire la fase acquosa superiore (circa 500 μL) in un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere 1 volume di isopropanolo (500 μL) e 0,1 volume di 3 M di acetato di sodio pH 5,5 (50 μL), mescolare bene invertendo e precipitando 10 min a -20 °C. NOTA: L'uso di acetato di sodio (NaOAc) è raccomandato al fine di migliorare la precipitazione dell'RNA. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto prolungando la precipitazione dell'RNA per alcune ore o anche durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare per 30 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare il supernatante.</li>
		<li>Lavare il pellet due volte con 500 μL di 80% EtOH, centrifugare per 5 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare.</li>
		<li>Lavare il pellet una volta con 500 μL 99% EtOH, centrifugare per 5 min a 12.000 x g a 4 °C e scartare.</li>
		<li>Asciugare il pellet per 5-10 minuti e sciogliere in 30 μL di H2O privo di RNasi. NOTA: Utilizzare invece qualsiasi protocollo di estrazione dell'RNA preferito (ad esempio, un sistema basato su colonne). Se nel protocollo è inclusa una digestione della DNasi, saltarla nel passaggio seguente (passaggio 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA (ad esempio, con l'uso di uno spettrofotometro) e digerire 20 μg di RNA con DNasi. NOTA: Il DNA è ricco di m5C e l'anticorpo non distingue tra DNA e RNA.<ol>
<li>In una tipica reazione di DNasi, trattare 10 μg di RNA in una reazione di 50 μL. Mescolare i seguenti componenti e incubare le reazioni a 37 °C per 30 minuti: 10 μg di RNA x μL 10x Tampone di DNasi 5 μL DNasi 1 μL (2 unità) RNasi-free H2O fino a 50 μL</li>
		<li>Rimuovere l'enzima aggiungendo un volume appropriato di reagente di inattivazione della DNasi (se è incluso nel kit DNasi e secondo le istruzioni del produttore) o eseguendo una fase di pulizia (ad esempio, purificazione della colonna o estrazione fenolo /cloroformio).</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare la qualità e la purezza dell'RNA isolato per elettroforesi capillare e procedere se il numero di integrità dell'RNA (RIN) è superiore a 7, per garantire che i campioni siano di buona qualità.</li>
	<li>OPTIONAL: Rimuovere l'RNA ribosomiale per arricchire i campioni in contenuto di mRNA utilizzando un kit di rimozione dell'rRNA e secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Utilizzare l'RNA trattato con DNasi del passaggio precedente per le reazioni di esaurimento dell'rRNA. Eseguire reazioni multiple se la quantità di RNA totale è superiore alla quantità massima suggerita per la reazione.</li>
		<li>Si noti che solo il 5-10% della quantità di input verrà recuperato dopo l'esaurimento dell'rRNA. Procedere con l'RNA impoverito di rRNA (uguale quantità per tutti i campioni) e ignorare le quantità menzionate nei seguenti passaggi, in quanto si riferiscono all'RNA totale. NOTA: Per un confronto e una descrizione dei metodi di esaurimento rRNA disponibili vedere riferimenti 38,39,40. l'rRNA è la maggior parte dell'RNA totale ed è metilato m5C in molti organismi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare in anticipo le trascrizioni in vitro (IVT) da utilizzare come sequenze di RNA di controllo e aggiungerle nei campioni.<ol>
<li>Produrre due T IVT distinti utilizzando un kit di trascrizione in vitro, uno con nucleosidi non metilati e uno in cui rCTP è sostituito da 5-metil-rCTP, per servire rispettivamente come controlli negativi e positivi nel MeRIP. Le trascrizioni preparate erano quelle di EGFP e Renilla luciferasi. NOTA: Gli TIC non dovrebbero esistere nel trascrittame dell'organismo che si sta analizzando. Se gli TIC provengono dallo stesso modello (ad esempio, entrambi EGFP), aggiungere il controllo positivo e negativo in due campioni diversi. Se la loro sequenza è diversa (ad esempio, EGFP e Renilla), possono essere aggiunti allo stesso campione.</li>
		<li>Picco in ogni campione 0,1 ng IVT per 3 μg di RNA, come controlli.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicare l'RNA a circa 100 nt frammenti. NOTA: Le condizioni per la tranciatura dell'RNA devono essere regolate in anticipo e differiscono per ogni sonicatore. Per il modello qui utilizzato, la sonicazione viene eseguita con le seguenti condizioni: Potenza di picco 174, Fattore di servizio 10, Cicli / burst 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicare la stessa quantità di RNA per tutti i campioni, almeno 12 μg di RNA per campione in 80 μL di volume totale (min 60 μL, max 100 μL), riempito con H2O privo di RNasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare l'efficienza della sonicazione e la concentrazione dei campioni di RNA per elettroforesi capillare. La dimensione media dell'RNA frammentato dovrebbe essere di circa 100 nt.</li>
</ol>2. Immunoprecipitazione dell'RNA metilato (MeRIP)
<ol><li>Nei tubi a bassa legatura, aggiungere 9 μg di RNA sonicato e H2O privo di RNasi fino a 60 μL (o più, a seconda della concentrazione).</li>
	<li>Dissociare le strutture secondarie riscaldando l'RNA a 70 °C in un bagno d'acqua per 10 minuti e raffreddando per altri 10 minuti in un mix ghiaccio-acqua.</li>
	<li>Dividere il campione in tre parti: un terzo (20 μL, se nel passaggio 2.1 sono stati prelevati 60 μL) viene salvato in un tubo separato a -80 °C come campione di input. Riempire i restanti 40 μL con H2O senza RNasi fino a 860 μL e quindi dividersi in due tubi a bassa legatura: uno per IP e uno per il controllo Mock (430 μL ciascuno).</li>
	<li>Aggiungere ad entrambi i tubi: 50 μL di tampone MeRIP 10x 10 μL di inibitore della RNasi 10 μL di anticorpo α-m5C (10 μg) nel campione IP per 10 μL di H2O nel campione Mock NOTA: Il clone di anticorpi utilizzato in precedenza non è più disponibile in commercio. Tuttavia, qualsiasi anticorpo monoclonale anti-5-metilcitosina dovrebbe funzionare allo stesso modo. Gli anticorpi devono essere testati per verifica della specificità prima dell'uso per meRIP11,23.</li>
	<li>Sigillare i tubi con parafilm e incubare per 12-14 ore a 4 °C, con rotazione aerea.</li>
	<li>Il giorno dopo, preparare le perline magnetiche G proteiche per il legame.<ol>
<li>Per ogni tubo (controllo IP o Mock), utilizzare 40 μL di perline. Aggiungere la quantità totale di perline (# di tubi x 40 μL, ad esempio, per 2 campioni IP e 2 Mock, sono necessari 160 μL di perline) in un tubo da 15 ml e lavare tre volte con 800 μL di tampone MeRIP 1x per campione (# di tubi x 800 μL buffer, ad esempio 3,2 ml per 2 campioni IP e 2 Mock).</li>
		<li>Eseguire lavaggi a temperatura ambiente per 5 minuti con rotazione aerea, raccogliere le perline con l'aiuto di un rack magnetico e scartare il tampone di lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, resuspend le perline nello stesso volume di tampone MeRIP 1x del volume iniziale di perline prelevate (# di tubi x 40 μL, ad esempio 160 μL di tampone MeRIP 1x per 2 campioni IP e 2 Mock). NOTA: La quantità di perline G proteiche utilizzate è determinata dalla capacità di legame delle perline per il tipo di anticorpo specifico e dalla quantità di anticorpi utilizzati. In questo caso, le perline hanno una capacità di legame di circa 8 μg di IgG di topo per mg di perline e 30 mg/mL di concentrazione. Pertanto, 40 μL sono sufficienti per legare circa 9,6 μg di anticorpi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 40 μL di perline rimorsi a ciascun campione IP e Mock e incubare per ulteriori 2 ore a 4 °C, con rotazione aerea.</li>
	<li>Posizionare i tubi su un rack magnetico per 1 minuto e scartare il supernatante o salvarlo come controllo (campione di RNA non legato).</li>
	<li>Lavare le perline 5 volte riutilizzando in 700 μL di 1 tampone MeRIP fornito con 0,01% Tween 20 e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione aerea.</li>
	<li>Rimescolare le perline lavate in 200 μL di tampone di digestione Proteinasi K e aggiungere 3,5 μL di Proteinasi K. Incubare per 3 ore a 50 °C, tremando a 800 giri/min. Occasionalmente, scorrere manualmente il fondo del tubo se un sedimento di perline si sta formando durante l'incubazione.</li>
	<li>Estrarre l'RNA con l'aggiunta di 800 μL di reagente di estrazione dell'RNA e seguendo un protocollo di estrazione acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio, e continuare come nella fase 1.2. Per aumentare la visibilità del pellet di RNA, un co-precipitante colorato può essere aggiunto in isopropanolo nella fase di precipitazione. Rimescolare il pellet in 20 μL di H2O privo di RNasi (o uguale al volume di ingresso mantenuto nel passaggio 2.3).</li>
</ol>3. Analisi a valle
<ol><li>Inviare gli esempi Input e IP per il sequenziamento a estremità singola con 50 basi di lunghezza di lettura (SE50).</li>
	<li>Tagliare gli adattatori finali da 3' utilizzando cutadapt41 e scartare letture inferiori a 48 nt.</li>
	<li>Mappa tagliata legge sul genoma arabidopsis (annotazione TAIR10) utilizzando STAR42 con un taglio del 6% per disallineamenti e dimensione massima dell'introne di 10 kb. Mantieni letture mappate in modo univoco per ulteriori analisi.</li>
	<li>Identificare i frammenti di RNA arricchiti nei campioni IP rispetto all'input utilizzando due metodi distinti e considerare quelli che si trovano significativamente arricchiti da entrambi.<ol>
<li>Innanzitutto, rilevare i picchi merip-seq utilizzando il chiamante di picco MACS243 sugli IP in pool rispetto all'input.</li>
		<li>In secondo luogo, seguire l'analisi per le chiamate di picco MeRIP-seq comedescritto in Meyer etal.<ol>
<li>Utilizzando script R personalizzati, dividere il genoma in distinte finestre da 25 nt e contare il numero di letture mappate in modo univoco per ogni finestra in base alla posizione dell'ultimo nucleotide mappato (poiché le letture provengono da 100 frammenti di RNA nt).</li>
			<li>Calcolare finestre significativamente arricchite in campioni IP rispetto all'input con il test fisher exact. Utilizzare la procedura Benjamini-Hochberg per correggere più test.</li>
			<li>Mantieni i picchi significativamente arricchiti che si estendono su almeno due finestre consecutive e scarta i picchi che coprono una sola finestra.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare le regioni annotate del genoma (trascrizioni) con picchi significativamente arricchiti trovati con entrambi i metodi.</li>
	<li>In alternativa o in modo complementare, testare obiettivi di RNA specifici per il loro arricchimento nei campioni IP.<ol>
<li>Trascrivere inversamente l'RNA (stesso volume di campioni Input, IP e Mock) con esameri casuali.</li>
		<li>Eseguire PCR quantitativo in tempo reale sulle destinazioni scelte, confrontando Input, IP e Mock tramite il metodo ΔΔCt. NOTA: Il prodotto generato non deve essere più lungo di 100 bp, poiché questa è la dimensione media della frammentazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

L'RNA trasporta più di cento distinte modifiche di base4 che formano l'epitranscriptome44. Queste modifiche aggiungono un ulteriore livello di regolazione della traduzione e della segnalazione (rivisto in5,6,8,20,45,46). I primi studi sono stati in grado di rilevare la presenza di modifiche post-trascrizionale sull'RNA28,47, ma gli RNA modificati specifici devono essere identificati per comprendere il ruolo dell'epitranscriptomica. MeRIP è stato progettato come metodo per mappare i siti di metilazione dell'RNA a livello di trascrizione21,22. Può essere adattato a qualsiasi modifica, se è disponibile un anticorpo specifico.
La forza principale di questo protocollo è che è relativamente semplice, sicuro per l'RNA e l'utente (ad esempio, 5-azaC è altamente tossico per le piante e l'uomo) e non richiede informazioni enzimatiche di sequenza o modifica. Inoltre, l'arricchimento delle RNA metilate da parte del PI aumenta le possibilità di rilevati mRNA a bassa abbondanza, a differenza del sequenziamento della bisolfito che non contiene una fase di arricchimento. Quando vengono eseguiti due cicli seriali di MeRIP, l'arricchimento in frammenti di RNA contenenti siti di metilazione aumenta ulteriormentedi 22. Una delle limitazioni del MeRIP, specialmente se applicata agli studi di metilazione dell'mRNA, è l'alta quantità di RNA richiesta come input per il saggio. Il passo di ribodeplezione - o arricchimento poli(A) - ridurrà lo sfondo causato dall'RNA ribosomiale pesantemente modificato, ma rimuove oltre il 90% dell'RNA totale. Anche il DNA deve essere completamente rimosso in quanto ricco di citosi metilate a 5 metilati. Un altro inconveniente è la minore risoluzione della posizione esatta della metilazione. La sonicazione dell'RNA prima dell'incubazione con l'anticorpo aiuta in questa direzione restringendo la regione contenente la modifica a 100-200 nucleotidi. Quando il MeRIP è combinato con il sequenziamento profondo, la risoluzione della previsione del sito m5C aumenta man mano che le letture di sequenziamento formano una distribuzione gaussiana attorno al potenziale sito di metilazione. Inoltre, la specificità dell'anticorpo deve essere confermata prima del test (ad esempio, con test di macchie di RNA dot, eseguite con oligidi sintetizzati con nucleotidi modificati), tuttavia, in che misura un anticorpo può effettivamente distinguere tra modifiche strettamente correlate (ad esempio, m6A e m6Am) è un punto di discussione nelcampo 48,49. Inoltre, gli RNA altamente strutturati potrebbero interferire con l'interazione anticorpo-antigene, un'altra restrizione che viene principalmente affrontata con la frammentazione e la denaturazione dell'RNA prima della PI. Al contrario, il sequenziamento della bisulfite che è anche influenzato da strutture secondarie, non include una fase di frammentazione e questo potrebbe essere uno dei motivi che causa discrepanza tra i siti m5C e gli mRNA previsti dal sequenziamento bisolfito16 e MeRIP-seq11,17. Anche altre modifiche della citosina (ad esempio, hm5C) sono resistenti alla deaminazione mediata dalla bisolfito35.
Le modifiche di MeRIP-seq includono un passaggio di reticolo, sia con l'introduzione di un ribonucleoside fotoattivibile (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50) o utilizzando la luce UV per creare collegamenti incrociati anticorpo-RNA dopo l'IP (miCLIP49, metodo diverso rispetto al miCLIP descritto nell'introduzione30, ma anche con risoluzione del nucleotide individuale). In futuro, e poiché le conoscenze sulla metilazione dell'RNA si stanno accumulando, potrebbero essere preferibili approcci più mirati, basati sugli enzimi di modifica e/o sulle sequenze di consenso in cui appare la metilazione. L'identificazione delle proteine del lettore è essenziale per la comprensione della funzione molecolare e di segnalazione delle modifiche post-trascrizionale. La tecnologia di sequenziamento dei nanopore consente già l'identificazione diretta di nucleotidi modificati senza trattamento preventivo dell'RNA17, ma c'è ancora spazio per miglioramenti in questo campo per quanto riguarda la profondità della sequenza e l'analisi bioinformatica. Nel complesso, MeRIP-seq è attualmente un approccio consolidato, affidabile e imparziale per identificare le trascrizioni di RNA metilato.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

In tutti e tre i regni della vita, le specie di RNA subiscono modifiche post-trascrizionali e la ricerca su queste modifiche biochimiche funzionalmente rilevanti è chiamata "epitranscriptomica". L'epitranscriptomica è un campo in crescita e sono in fase di sviluppo vari metodi per studiare e mappare le modifiche sulle molecole di RNA (esaminate in1,2). Sono state trovate più di un centinaio di modifiche all'RNA, rilevate in rRNA, tRNA, altri ncRNA, nonché mRNA3,4. Sebbene la presenza e la funzione di modifiche post-trascrittivi chimicamente diverse in tRNA e rRNA siano ampiamentestudiate 5,6,7,8, solo di recente sono state caratterizzate modifiche all'mRNA. Nelle piante, molte modifiche dell'mRNA sono state identificate fino ad oggi, tra cui m7G alla struttura delcappuccio 9,m1A10, hm5C11,12e uridylation13. Tuttavia, solo m6A10,14,15, m5C11,16,17e pseudouridina18 sono stati mappati a livello di trascrizione in Arabidopsis. Le modifiche alla base dell'mRNA post-trascrizionale sono coinvolte in diversi processidi sviluppo 19,20.
Uno degli approcci più comunemente usati nell'epitranscriptomica è l'immunoprecipitazione dell'RNA metilata accoppiata al sequenziamento profondo (MeRIP-seq). MeRIP-seq è stato sviluppato nel 2012 per studiare m6A nelle cellule dimammifero 21,22. Richiede l'uso di un anticorpo per la modifica desiderata e mira ad arricchire per i frammenti di RNA che trasportano i nucleotidi modificati. Di solito è seguito da un sequenziamento profondo per identificare e mappare i frammenti arricchiti o la PCR quantitativa per verificare specifici obiettivi di RNA. L'accuratezza del MeRIP si basa sulla specificità dell'anticorpo per riconoscere il nucleotide modificato rispetto a modifiche simili (ad esempio, m5C e hm5C11,23). Oltre a m6A, MeRIP-seq è stato applicato anche allo studio m1A e m5C metilazione RNA in diversiorganismi 11,17,23,24,25.
La metilazione della citosina alla quinta posizione di carbonio (m5C) è la modificazione del DNA più diffusa26,27 e una delle modifiche più comuni dell'RNAtroppo 3,4. Mentre m5C è stato rilevato in mRNA eucarioti nel 197528, solo di recente hanno studi focalizzati sulla mappatura della modifica a livello di trascrizione, in RNA di codifica e non codifica11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
I metodi alternativi utilizzati nellaricerca sull'RNAm 5 C includono la conversione chimica delle citosina non metilate in uracili (sequenziamento della bisolfito) e test di immunoprecipitazione basati su un legame irreversibile di una citosina RNA nota metiltransferasi ai suoi bersagli di RNA (miCLIP, aza-IP). In breve, il sequenziamento della bisulfite sfrutta la caratteristica della citosina 5 metilata per essere resistente al trattamento con bisolfito di sodio che deamina citosina non modificata all'uracile. Il metodo è stato sviluppato per la prima volta per il DNA ma adattato anche per l'RNA e molti studi hanno scelto questo approccio per rilevare siti m5C in RNA16,23,29,32,34,35. Sia miCLIP che aza-IP richiedono una precedente conoscenza dell'RNA citosina metiltransferasi e l'uso del rispettivo anticorpo. Nel caso di miCLIP (metilazione crosslinking a risoluzione individuale nucleotidica e immunoprecipitazione), la metiltransferasi porta una singola mutazione amminoacidica in modo che si lega al substrato di RNA ma non può essererilasciata 30. Nell'immunoprecipitazione dell'RNA mediata da aza-IP (immunoprecipitazione dell'RNA mediata da 5-azacidina), il legame irreversibile si forma tra il nucleoside 5-azaC e l'RNA citosina metiltransferasi quando esogenamente fornito 5-azaC è incorporato da RNA polimerasi in una molecola di RNA bersaglio31.
Il vantaggio principale di questi tre metodi è che consentono la mappatura della risoluzione del singolo nucleotide di m5C. Inoltre, miCLIP e aza-IP forniscono informazioni sugli obiettivi specifici di un RNA citosina metiltransferasi selezionato, decifrando più in profondità il meccanismo e il ruolo delle modifiche dell'RNA post-trascrizionale. Tuttavia, l'approccio MeRIP-seq può identificare le regioni m5C a livello di trascrittome senza alcuna conoscenza precedente richiesta ed evita condizioni chimiche e di temperatura difficili, come il trattamento con bisolfito o l'incubazione con 5-azaC. Sia il sequenziamento del MeRIP che quello della bisolfito possono essere inibiti dalle strutture secondariedell'RNA 36. La fase di frammentazione inclusa nel saggio MeRIP prima dell'immunoprecipitazione mira a facilitare il legame anticorpale e ad aumentare la risoluzione dell'identificazione m5C.
Un altro metodo degno di nota è la spettrometria di massa (MS) dei nucleosidi dell'RNA. La SM può rilevare e distinguere qualsiasi tipo di modifica sia sul DNA che sull'RNA. In breve, l'RNA viene estratto e la DNasi digerita, quindi dissaledata e digerita in singoli nucleosidi. I nucleosidi dell'RNA sono analizzati da uno spettrometro di massa. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare i livelli di ogni modifica e non si basa su un anticorpo o una conversione chimica. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che fornisce informazioni in blocco sulla presenza di modifiche all'RNA. Per mappare le modifiche, la SM deve essere combinata con la digestione della RNasi e le informazioni di sequenziamento su molecole di RNA specifiche, come nel caso del tRNAumano Leu(CAA)37.
Qui descriviamo e discutiamo il saggio MeRIP utilizzato per studiare lametilazione dell'RNAm 5 C in Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Le modifiche di base secondarie sull'RNA, come m5C, influenzano la struttura e la funzione delle molecole di RNA modificate. L'immunoprecipitazione e sequenziamento dell'RNA metilato (MeRIP-seq) è un metodo che mira ad arricchire l'RNA metilato e infine identificare trascrizioni modificate. In breve, l'RNA sonicato viene incubato con un anticorpo per citosina 5 metilate e precipitato con l'aiuto di perline proteiche G. I frammenti arricchiti vengono quindi sequenziati e i potenziali siti di metilazione vengono mappati in base alla distribuzione delle letture e al rilevamento dei picchi. MeRIP può essere applicato a qualsiasi organismo, in quanto non richiede alcuna sequenza precedente o modifica della conoscenza enzimatica. Inoltre, oltre alla frammentazione, l'RNA non è sottoposto ad alcun altro trattamento chimico o di temperatura. Tuttavia, MeRIP-seq non fornisce una previsione mono nucleotidica del sito di metilazione come fanno altri metodi, anche se l'area metilata può essere ristretta ad alcuni nucleotidi. L'uso di diversi anticorpi specifici della modifica consente di regolare merip per le diverse modifiche di base presenti sull'RNA, espandendo le possibili applicazioni di questo metodo.

Uno schema del metodo è fornito nella figura 1. I primi passaggi critici del protocollo sono ottenere RNA di buona qualità (RIN ≥ 7) e sonicarlo a circa 100 nt frammenti. L'efficienza di entrambe le fasi viene esaminata da una macchina per elettroforesi capillare a base di chip. Nella figura 2Aviene mostrata una corsa rappresentativa di un buon campione di RNA. Il campione viene diluito 1:10 prima del caricamento sul chip per avere una concentrazione che si trova nell'intervallo di rilevamento del kit utilizzato (5-500 ng/μL). Lo stesso campione viene eseguito anche dopo la sonicazione ed è mostrato nella figura 2B. Si noti la presenza di un picco uniforme spostato a sinistra del diagramma, con una dimensione di circa 100 nucleotidi. La concentrazione inferiore è causata sia dalla perdita di RNA durante la frammentazione, ma anche dall'aumento del volume dei campioni (60-100 μL, fase 1.7.1).
La qualità degli esempi IP e Mock può essere valutata da qRT-PCR. A tal fine, gli TIC a spillo fungono da controlli positivi e negativi: l'IVT metilato, dove in tutte le posizioni di citosina c'è m5C, dovrebbe essere altamente arricchito nel campione IP; al contrario, l'IVT non metilato non dovrebbe avere una differenza tra IP e Mock. I primer utilizzati nel saggio qRT-PCR per i due VTT di controllo(EGFP e Renilla luciferase) sono elencati nella tabella 1. Infatti, come mostrato nella figura 3, circa l'80% dell'IVT metilato è stato recuperato nel campione IP e solo circa il 2% nel Mock. Per il controllo non metilato, il recupero è stato inferiore all'1% sia nei campioni IP che Mock. Ciò verifica l'efficienza del MeRIP che i frammenti di RNA metilati sono stati precipitati e arricchiti, ed è un buon indicatore che i campioni possono essere utilizzati per l'analisi a valle. Inoltre, l'arricchimento delle pieghe dell'IVT non metilato (rapporto IP-Mock) può essere applicato come soglia per stimare la significatività dell'arricchimento nei test qRT-PCR.
Dopo aver allineato le letture al genoma (Figura 4), gli algoritmi di chiamata di picco descritti nei passaggi 3.4.1 e 3.4.2 vengono applicati per identificare le finestre statisticamente significative, arricchite nei campioni IP rispetto all'Input. Le sequenze che corrispondono a queste finestre possono essere utilizzate ulteriormente, ad esempio per cercare motivi conservati correlati alla metilazione11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo MeRIP-seq. I campioni di RNA vengono incubati con un anticorpo per citosina 5 metilati e i complessi vengono abbattuti con perline magnetiche G proteiche che catturano gli anticorpi insieme all'RNA legato. I campioni di RNA eluitati vengono analizzati mediante sequenziamento profondo e qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Risultati rappresentativi dell'analisi della qualità dei campioni di RNA. (A) Profilo rappresentativo di un campione totale qualificato di impianto di RNA. (B) Profilo rappresentativo di un campione di RNA dopo sonicazione a 100 nt frammenti. File di output dal software di elettroforesi capillare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: analisi qRT-PCR degli IVT di controllo. Le trascrizioni in vitro metilate e non metilate sono state utilizzate rispettivamente come controlli positivi e negativi del saggio MeRIP. Dopo l'immunoprecipitazione, l'IVT metilato è altamente arricchito nel campione IP (verde) ma non nel campione Mock (senza anticorpo anti-m5C; viola). L'IVT non metilato non ha mostrato alcun arricchimento e nessuna differenza tra IP e Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Leggere l'allineamento prima e dopo merip intorno a una trascrizione rappresentativa. Letture allineate a una trascrizione specifica nell'esempio input (riga superiore) e in due repliche IP (riga centrale e inferiore). La scatola nera mostra una finestra lunga 50 nt arricchita identificata basata su analisi di picco MACS243 e MeRIP-seq22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>bersaglio</td>
			<td colspan="2">Coppia primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza del prodotto</td>
			<td>Lunghezza del prodotto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Per: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferasi</td>
			<td colspan="2">Per: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Informazioni sui primer e sui prodotti generati per l'analisi qRT-PCR.
Ricette tampone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K Views.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

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A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Un metodo per l&#39;RNA di misura<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modifiche di cellule e tessuti

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Ricerca

Biochimica

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genetica

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Biologia dello sviluppo

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Chimica

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell&#39;endosperma

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biologia

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m⁵C Modifica in Arabidopsis

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un metodo per l'RNA di misura

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell'endosperma

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA

Esplorare gli epitrascrittomi ^m6A e ^m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV