Ces travaux ont été soutenus par une allocation de doctorat IMPRS à E.S., une bourse de longue durée de l’EMBO à V.P., et des fonds internes MPI-MPP à F.K. Une partie de ces travaux a également été financée par le PLAMORF, un projet qui a reçu des fonds du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne (accord de subvention n° 810131). Les auteurs remercient Federico Apelt pour l’analyse bioinformatique et les commentaires sur le manuscrit, ainsi que Mathieu Bahin et Amira Kramdi pour l’analyse bioinformatique.

1. Préparation de l’ARN
<ol><li>Moudre 200 mg de tissu végétaux en poudre dans de l’azote liquide, en s’assurant que le tissu reste gelé tout au long de la procédure.</li>
	<li>Extraire l’ARN du tissu végétal désiré suivant un protocole acide d’extraction de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme. Pour diminuer la possibilité de contaminer l’ARN avec l’ADN pendant la séparation de phase, utilisez 1-bromo-3-chloropropane au lieu de chloroforme.<ol>
<li>Ajouter 1 mL de reagent d’extraction d’ARN contenant du thiocyanate de guanidine et du phénol acide au tissu végétal broyé (500 μL par tissu de 100 mg). Bien mélanger en inversant et assurez-vous que tous les tissus sont mouillés. Incuber pendant 10 min à température ambiante pour dissocier les complexes ribonucléoprotéines.</li>
		<li>Centrifugeuse de 10 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert du supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de 1-bromo-3-chloropropane (100 μL par 500 μL de réagent d’extraction d’ARN) et vortex vigoureusement.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C et transfert de la phase aqueuse supérieure (environ 500 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 1 volume d’isopropanol (500 μL) et 0,1 volume de 3 M de pH d’acétate de sodium 5,5 (50 μL), bien mélanger en inversant et précipiter 10 min à -20 °C. REMARQUE : L’utilisation de l’acétate de sodium (NaOAc) est recommandée afin d’augmenter les précipitations d’ARN. Le protocole peut être mis en pause à ce stade en prolongeant les précipitations d’ARN pendant quelques heures ou même toute la nuit.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 30 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter le supernatant.</li>
		<li>Laver la pastille deux fois avec 500 μL de 80% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter.</li>
		<li>Laver la pastille une fois avec 500 μL 99% EtOH, centrifugeuse pendant 5 min à 12 000 x g à 4 °C et jeter.</li>
		<li>Sécher la pastille de 5 à 10 minutes et dissoudre en 30 μL de H2O sans RNase. REMARQUE : Utilisez plutôt n’importe quel protocole d’extraction d’ARN de choix (p. ex., un système basé sur des colonnes). Si une digestion DNase est incluse dans le protocole, sautez-la dans l’étape suivante (étape 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Mesurer la concentration d’ARN (p. ex., à l’utilisation d’un spectrophotomètre) et digérer 20 μg d’ARN avec du DNase. REMARQUE : L’ADN est riche en m5C et l’anticorps ne fait pas de distinction entre l’ADN et l’ARN.<ol>
<li>Dans une réaction typique de DNase, traitez 10 μg d’ARN dans une réaction de 50 μL. Mélanger les composants suivants et incuber la réaction (s) à 37 °C pendant 30 min : 10 μg d’ARN x μL Tampon 10x DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unités) H2O sans RNase jusqu’à 50 μL</li>
		<li>Retirez l’enzyme soit en ajoutant un volume approprié de réacgage d’inactivation DNase (si elle est incluse dans le kit DNase et selon les instructions du fabricant) soit en effectuant une étape de nettoyage (p. ex., purification des colonnes ou extraction de phénol/chloroforme).</li>
	</ol></li>
	<li>Vérifiez la qualité et la pureté de l’ARN isolé par électrophorèse capillaire et procédez si le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7, pour s’assurer que les échantillons sont de bonne qualité.</li>
	<li>FACULTATIF : Enlevez l’ARN ribosomal pour enrichir les échantillons dans la teneur en ARNm à l’aide d’un kit d’enlèvement de rRNA et selon le protocole du fabricant.<ol>
<li>Utilisez l’ARN traité par DNase de l’étape précédente pour la réaction d’épuisement rRNA(s). Effectuez plusieurs réactions si la quantité totale d’ARN est supérieure à la quantité maximale suggérée pour la réaction.</li>
		<li>Notez que seulement 5-10% de la quantité d’entrée sera récupérée après épuisement de rRNA. Procéder à l’ARN appauvri rRNA (quantité égale pour tous les échantillons) et ignorer les quantités mentionnées dans les étapes suivantes, comme ils se réfèrent à l’ARN total. REMARQUE : Pour une comparaison et une description des méthodes disponibles d’épuisement de rRNA voir références 38,39,40. rRNA est la majeure partie de l’ARN total et est m5C méthylé dans de nombreux organismes.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez à l’avance des transcriptions in vitro (IVT) pour être utilisées comme séquences d’ARN de contrôle et ajoutez-les dans les échantillons.<ol>
<li>Produire deux IVT distincts à l’aide d’un kit de transcription in vitro, l’un avec des nucléosides non méthylés et l’autre où le RCTP est remplacé par 5-méthyl-rCTP, pour servir de contrôles négatifs et positifs dans MeRIP, respectivement. Les transcriptions préparées étaient celles de l’EGFP et de Renilla luciferase. REMARQUE : Les IVT ne devraient pas exister dans le transcriptome de l’organisme que vous analysez. Si les IVT proviennent du même modèle (p. ex., les deux EGFP), ajoutez le contrôle positif et négatif dans deux échantillons différents. Si leur séquence est différente (p. ex., EGFP et Renilla), ils peuvent être ajoutés au même échantillon.</li>
		<li>Spike dans chaque échantillon 0,1 ng IVT par 3 μg d’ARN, comme contrôles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicate l’ARN à environ 100 fragments de nt. REMARQUE : Les conditions de cisaillement de l’ARN doivent être ajustées à l’avance et elles diffèrent pour chaque sonicateur. Pour le modèle utilisé ici, la sonication est effectuée avec les conditions suivantes: Puissance de pointe 174, Facteur de service 10, Cycles /burst 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate la même quantité d’ARN pour tous les échantillons, au moins 12 μg d’ARN par échantillon dans 80 μL de volume total (min 60 μL, max 100 μL), rempli de H2O sans RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmer l’efficacité de la sonication et la concentration des échantillons d’ARN par électrophoresis capillaire. La taille moyenne de l’ARN fragmenté devrait être d’environ 100 nt.</li>
</ol>2. Immunoprécipation de l’ARN méthylé (MeRIP)
<ol><li>Dans les tubes à faible liaison, ajouter 9 μg d’ARN sonique et H2O sans RNase jusqu’à 60 μL (ou plus, selon la concentration).</li>
	<li>Dissocier les structures secondaires en chauffant l’ARN à 70 °C dans un bain d’eau pendant 10 minutes et en refroidissant pendant 10 minutes supplémentaires dans un mélange d’eau glacée.</li>
	<li>Divisez l’échantillon en trois parties : un tiers (20 μL, si 60 μL ont été prélevés à l’étape 2.1) est enregistré dans un tube séparé à -80 °C comme échantillon d’entrée. Remplissez les 40 μL restants de H2O sans RNase jusqu’à 860 μL, puis divisez-les en deux tubes à faible liaison : un pour ip et un pour le contrôle Mock (430 μL chacun).</li>
	<li>Ajouter aux deux tubes : 50 μL de tampon MeRIP 10x 10 μL d’inhibiteur du RNase 10 μL d’anticorps α m5C (10 μg) dans l’échantillon IP par 10 μL de H2O dans l’échantillon Mock REMARQUE : Le clone d’anticorps utilisé précédemment n’est plus disponible dans le commerce. Cependant, n’importe quel anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine devrait fonctionner de la même manière. Les anticorps doivent être testés pour la spécificité avant d’être utilisés pour MeRIP11,23.</li>
	<li>Sceller les tubes avec du parafilm et incuber pendant 12-14 heures à 4 °C, avec rotation aérienne.</li>
	<li>Le lendemain, préparez les perles magnétiques de protéine G pour la reliure.<ol>
<li>Pour chaque tube (contrôle IP ou Mock), utilisez 40 μL de perles. Ajouter la quantité totale de perles (# de tubes x 40 μL, par exemple, pour 2 échantillons IP et 2 échantillons simulés, 160 μL de perles sont nécessaires) dans un tube de 15 mL et lavent trois fois avec 800 μL de tampon MeRIP 1x par échantillon (# de tubes x 800 tampon μL, par exemple, 3,2 mL pour 2 échantillons IP et 2 échantillons de maquettes).</li>
		<li>Effectuez des lavages à température ambiante pendant 5 min avec rotation aérienne, recueillez les perles à l’aide d’un support magnétique et jetez le tampon de lavage. Après le troisième lavage, resuspendez les perles dans le même volume de tampon MeRIP 1x que le volume initial de perles prises (# de tubes x 40 μL, par exemple, 160 μL de tampon MeRIP 1x pour 2 échantillons IP et 2 simulacres). REMARQUE : La quantité de perles de protéines G utilisées est déterminée par la capacité de liaison des perles pour le type d’anticorps spécifique et la quantité d’anticorps utilisée. Dans ce cas, les perles ont une capacité contraignante d’environ 8 μg de souris IgG par mg de perles et 30 mg/mL de concentration. Par conséquent, 40 μL sont suffisants pour lier environ 9,6 μg d’anticorps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 40 μL de perles résuspendées à chaque échantillon IP et Mock et incuber pendant 2 heures supplémentaires à 4 °C, avec rotation aérienne.</li>
	<li>Placez les tubes sur une grille magnétique pendant 1 min et jetez le supernatant ou enregistrez-le comme un contrôle (échantillon d’ARN non lié).</li>
	<li>Lavez les perles 5 fois en réutilisant 700 μL de tampon 1x MeRIP fourni avec 0,01% de Tween 20 et en couveant pendant 10 min à température ambiante avec rotation aérienne.</li>
	<li>Resuspendez les perles lavées en 200 μL de tampon de digestion Proteinase K et ajoutez 3,5 μL de Proteinase K. Incubez pendant 3 heures à 50 °C, en secouant à 800 rpm. Parfois, feuilletez manuellement le fond du tube si un sédiment de perles se forme pendant l’incubation.</li>
	<li>Extraire l’ARN par ajout de 800 μL de reagent d’extraction d’ARN et suivre un protocole acide d’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium, et continuer comme dans l’étape 1.2. Pour augmenter la visibilité de la pastille d’ARN, un co-précipitant coloré peut être ajouté dans l’isopropanol à l’étape de précipitation. Resuspendez la pastille en 20 μL de H2O sans RNase (ou égale au volume d’entrée maintenu à l’étape 2.3).</li>
</ol>3. Analyse en aval
<ol><li>Soumettez les échantillons d’entrée et de propriété intellectuelle pour le séquençage à extrémité unique avec 50 bases de longueur de lecture (SE50).</li>
	<li>Coupez les adaptateurs finaux de 3' à l’aide du cutadapt41 et jetez les lectures plus courtes que 48 nt.</li>
	<li>La carte taillée se lit sur le génome d’Arabidopsis (annotation TAIR10) à l’aide de STAR42 avec une coupure de 6 % pour les inadéquations et la taille maximale de l’intron de 10 kb. Conservez des lectures cartographiées de façon unique pour une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Identifier les fragments d’ARN enrichis dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée à l’aide de deux méthodes distinctes et tenir compte de ceux qui sont trouvés significativement enrichis par les deux.<ol>
<li>Tout d’abord, détectez les pics MeRIP-seq à l’aide de l’appelant de pointe MACS243 sur les adresses IP poolées par rapport à l’entrée.</li>
		<li>Deuxièmement, suivez l’analyse de l’appel de pointe MeRIP-seq tel que décrit dans Meyer et coll.22 et Yang et coll.17.<ol>
<li>À l’aide de scripts R personnalisés, divisez le génome en 25 fenêtres distinctes et comptez le nombre de lectures cartographiées de façon unique pour chaque fenêtre en fonction de la position du dernier nucléotide cartographié (puisque les lectures proviennent de 100 fragments d’ARN nt).</li>
			<li>Calculer les fenêtres considérablement enrichies dans les échantillons ip par rapport à l’entrée avec le test Fisher Exact. Utilisez la procédure Benjamini-Hochberg pour corriger pour plusieurs tests.</li>
			<li>Gardez les pics considérablement enrichis qui s’étendent sur au moins deux fenêtres consécutives et jetez les pics qui ne couvrent qu’une seule fenêtre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier les régions annotées du génome (transcriptions) avec des pics significativement enrichis trouvés par les deux méthodes.</li>
	<li>Alternativement ou de manière complémentaire, testez des cibles d’ARN spécifiques pour leur enrichissement dans les échantillons de propriété intellectuelle.<ol>
<li>Reverse transcrire l’ARN (même volume d’échantillons d’entrée, ip et simulacre) avec des hexamers aléatoires.</li>
		<li>Effectuez un PCR quantitatif en temps réel sur les cibles choisies, en comparant Input, IP et Mock via la méthode ΔΔCt. REMARQUE : Le produit généré ne doit pas être supérieur à 100 pb, car il s’agit de la taille moyenne de la fragmentation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Arn porte plus d’une centaine de modifications de base distinctes4 qui forment l’épitranscriptome44. Ces modifications ajoutent une couche supplémentaire de régulation de la traduction et de la signalisation (examinéeen 5,6,8,20,45,46). Les premières études ont permis de détecter la présence de modifications post-transcriptionnelles surl’ARN 28,47, mais les ARN modifiés spécifiques doivent être identifiés afin de comprendre le rôle de l’épitranscriptomie. MeRIP a été conçu comme une méthode pour cartographier les sites de méthylation de l’ARN transcriptome-large21,22. Il peut être adapté à toute modification, si un anticorps spécifique est disponible.
La principale force de ce protocole est que c’est relativement simple, sans danger pour l’ARN et l’utilisateur (par exemple, 5-azaC est très toxique pour les plantes et les humains) et ne nécessite pas de séquence ou de modifier l’information enzymatique. En outre, l’enrichissement des ARN méthylés par la propriété intellectuelle augmente les chances de détecter de faibles ARNH abondants, contrairement au séquençage de la bisulfite qui ne contient pas d’étape d’enrichissement. Lorsque deux séries de MeRIP sont effectuées, l’enrichissement dans les fragments d’ARN contenant des sites de méthylation augmenteencore 22. Une des limitations de MeRIP, particulièrement une fois appliquée aux études de méthylation d’ARNm, est la grande quantité d’ARN exigée comme entrée pour l’essai. L’étape ribodepletion – ou poly(A) – réduira l’arrière-plan causé par l’ARN ribosomal fortement modifié, mais elle enlève plus de 90 % de l’ARN total. L’ADN doit également être complètement éliminé car il est riche en cytosines 5 méthylés. Un autre inconvénient est la résolution inférieure de la position exacte de la méthylation. La sonication de l’ARN avant l’incubation avec l’anticorps contribue à cette direction en rétrécissant la région contenant la modification à 100-200 nucléotides. Lorsque le MeRIP est combiné avec un séquençage profond, la résolution de la prédiction du site m5C augmente à mesure que les lectures de séquençage forment une distribution gaussienne autour du site potentiel de méthylation. En outre, la spécificité de l’anticorps doit être confirmée avant l’analyse (p. ex., avec des essais de taches à points d’ARN, effectués avec des oligos synthétisés avec des nucléotides modifiés), cependant, dans quelle mesure un anticorps peut effectivement faire la distinction entre des modifications étroitement liées (p. ex., m6A et m6Am) est un argument dans le domaine48,49. En outre, les ARN hautement structurés pourraient interférer avec l’interaction anticorps-antigènes, une autre restriction qui est principalement abordée avec la fragmentation et la dénaturation de l’ARN avant la propriété intellectuelle. Au contraire, le séquençage de la bisulfite, qui est également affecté par les structures secondaires, n’inclut pas d’étape de fragmentation et cela pourrait être l’une des raisons qui causent l’écart entre les sites m5C et les ARNM prédits par le séquençage de la bisulfite16 et le MeRIP-seq11,17. D’autres modifications de cytosine (p. ex., hm5C) sont également résistantes à la déamination35 à 100 mentations 24 h/24.
Les modifications apportées à MeRIP-seq comprennent une étape de liaison croisée, soit avec l’introduction d’un ribonucleoside photoactivatable (photo-crosslinking-assisté m6A-seq, PA-m6A-seq 50) ou en utilisant la lumière UV pour créer des liens croisés anticorps-ARN après l’IP (miCLIP49, méthode différente de la miCLIP décrite dans l’introduction30, mais aussi avec la résolution individu-nucléotide). À l’avenir, et à mesure que les connaissances sur la méthylation de l’ARN s’accumulent, des approches plus ciblées pourraient être préférables, basées sur les enzymes modificateurs et/ou les séquences consensuelles où la méthylation apparaît. L’identification des protéines du lecteur est essentielle à la compréhension de la fonction moléculaire et de signalisation des modifications post-transcriptionnelles. La technologie de séquençage nanopore permet déjà l’identification directe des nucléotides modifiés sans traitement préalable del’ARN 17, mais il y a encore place à l’amélioration dans ce domaine en ce qui concerne la profondeur de la séquence et l’analyse bioinformatique. Dans l’ensemble, MeRIP-seq est actuellement une approche établie, fiable et impartiale pour identifier les transcriptions de l’ARN méthylé.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Dans les trois royaumes de la vie, les espèces d’ARN subissent des modifications post-transcriptionnelles et la recherche sur ces modifications biochimiques fonctionnellement pertinentes est appelée « épitranscriptomics ». Epitranscriptomics est un champ en pleine croissance et diverses méthodes sont en cours de développement pour étudier et cartographier les modifications sur les molécules d’ARN (examinéesdans 1,2). Plus d’une centaine de modifications de l’ARN ont été trouvées, détectées dans les ARN, les ARN, d’autres ARNN, ainsi que dans lesARNM 3,4. Bien que la présence et la fonction de modifications post-transcriptionnelles chimiquement diverses dans les ARN et les ARNr soientlargement étudiées 5, 6,7,8,seulementrécemmentont des modifications d’ARNm ont été caractérisées. Dans les plantes, de nombreuses modifications de l’ARNm ont été identifiées à ce jour, y compris m7G à la structure du bouchon9, m1A10, hm5C11,12, et l’uridylation13. Cependant, seulement m6A10,14,15, m5C11,16,17, et pseudouridine18 ont été cartographiés transcriptome-large dans Arabidopsis. Les modifications de base post-transcriptionnelles de l’ARNm sont impliquées dans plusieurs processusde développement 19,20.
L’une des approches les plus couramment utilisées en épitranscriptomics est l’immunoprécipitation méthylé de l’ARN couplée à un séquençage profond (MeRIP-seq). MeRIP-seq a été développé en 2012 pour étudier m6A dans les cellules mammifères21,22. Il nécessite l’utilisation d’un anticorps pour la modification souhaitée et vise à enrichir pour les fragments d’ARN transportant le nucléotide modifié. Il est généralement suivi d’un séquençage profond pour identifier et cartographier les fragments enrichis ou le PCR quantitatif pour vérifier des cibles d’ARN spécifiques. L’exactitude du MeRIP est basée sur la spécificité de l’anticorps pour reconnaître le nucléotide modifié sur des modifications similaires (p. ex., m5C et hm5C11,23). Outre m6A, MeRIP-seq a également été appliqué pour étudier la méthylation del’ARNM1A et m 5 C dansplusieurs organismes 11,17,23,24,25.
La méthylation de la cytosine à la cinquième position de carbone (m5C) est la modification de l’ADN la plusrépandue 26,27 et l’une des modifications d’ARN les pluscourantes trop 3,4. Alors que m5C a été détecté dans les ARNM eucaryotes en 197528, seulement récemment ont des études axées sur la cartographie de la modification transcriptome-large, dans le codage et le non-codage ARN11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Les méthodes alternatives utilisées dans larecherche sur l’ARNm 5 C comprennent la conversion chimique de cytosines non méthylées en uracils (séquençage de la bisulfite) et des analyses d’immunoprécipitation basées sur une liaison irréversible d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN connu vers ses cibles ARN (miCLIP, aza-IP). En bref, le séquençage de bisulfite exploite la caractéristique de la cytosine 5-méthylé pour être résistant au traitement de bisulfite de sodium qui désamine les cytosines non modifiées à l’uracil. La méthode a d’abord été développée pour l’ADN, mais adaptée à l’ARN aussi et de nombreuses études ont choisi cette approche pour détecter les sites m5C dansl’ARN 16,23,29,32,34,35. MiCLIP et aza-IP nécessitent des connaissances préalables sur la méthyltransferase de cytosine de l’ARN et l’utilisation de l’anticorps respectif. Dans le cas du miCLIP (méthylation individu-nucléotide-résolution de liaison croisée et immunoprécipitation), le méthyltransferase porte une mutation unique d’acide aminé de sorte qu’il se lie au substrat d’ARN mais ne peut pas êtrelibéré 30. Dans l’aza-IP (immunoprécipitation arn 5-azacytidine-médiée), la liaison irréversible est formée entre le nucléoside de 5 azaC et la méthyltransferase de cytosine d’ARN une fois exogènement fournie 5-azaC est incorporée par des polyméses d’ARN dans une molécule cibled’ARN 31.
Le principal avantage de ces trois méthodes est qu’elles permettent une cartographie unique de résolution nucléotide de m5C. En outre, miCLIP et aza-IP fournissent des informations sur les cibles spécifiques d’un méthyltransferase de cytosine d’ARN sélectionné, déchiffrant plus profondément le mécanisme et le rôle des modifications post-transcriptionnelles d’ARN. Toutefois, l’approche MeRIP-seq permet d’identifier les régions m5C à l’échelle du transcriptome sans aucune connaissance préalable requise et évite les conditions chimiques et de température difficiles, telles que le traitement de la bisulfite ou l’incubation avec 5 azaC. Le séquençage du MeRIP et de la bisulfite peut être inhibé par des structuresd’ARN secondaires 36. L’étape de fragmentation qui est incluse dans l’analyse MeRIP avant l’immunoprécipitation vise à faciliter la liaison anticorps et à augmenter la résolution del’identificationm 5 C.
Une autre méthode digne de mention est la spectrométrie de masse (SP) des nucléosides d’ARN. La SP peut détecter et distinguer tout type de modification à la fois sur l’ADN et sur l’ARN. Brièvement, l’ARN est extrait et DNase digéré, puis desalted et digéré aux nucléosides simples. Les nucléosides d’ARN sont analysés par un spectromètre de masse. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les niveaux de chaque modification et elle ne repose pas sur un anticorps ou une conversion chimique. Cependant, un inconvénient majeur est qu’il fournit des informations en vrac sur la présence de modifications de l’ARN. Afin de cartographier les modifications, la SP doit être combinée avec des informations sur la digestion et le séquençage de la RNase sur des molécules d’ARN spécifiques, comme dans le cas de l’ARNt humain Leu(CAA)37.
Ici, nous décrivons et discutons l’essai de MeRIP comme utilisé pour étudier la méthylationd’ARNde m 5 C dans Arabidopsis17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;&#8208;m5C antibody</td>
			<td>ZymoResearch</td>
			<td>A3001 (discontinued), A3002 available</td>
			<td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA 6000 Nano kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>TURBO DNA-free kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-precipitant of nucleic acids</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Glycoblue, 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-binding reaction tubes</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>G017</td>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>RNasin Plus 40 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rRNA removal kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RZPL11016</td>
			<td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication tubes</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis machine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>2100 Bioanalyzer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>5417R model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>R4040</td>
			<td>RotoBot Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td>S220 Focused-ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>NanoDrop OneC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1012</td>
			<td>1012 Incubation bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Les modifications secondaires de base sur l’ARN, telles que m5C, affectent la structure et la fonction des molécules modifiées d’ARN. Immunoprécipitation et séquençage de l’ARN méthylé (MeRIP-seq) est une méthode qui vise à enrichir l’ARN méthylé et, en fin de compte, à identifier les transcriptions modifiées. En bref, l’ARN sonicated est incubé avec un anticorps pour les cytosines 5-méthylées et précipité avec l’aide des perles de protéine G. Les fragments enrichis sont ensuite séquencés et les sites potentiels de méthylation sont cartographiés en fonction de la distribution des lues et de la détection maximale. MeRIP peut être appliqué à n’importe quel organisme, car il ne nécessite aucune séquence antérieure ou de modifier les connaissances enzymatiques. En outre, outre la fragmentation, l’ARN n’est soumis à aucun autre traitement chimique ou de température. Cependant, MeRIP-seq ne fournit pas de prédiction à nucléotide unique du site de méthylation comme le font d’autres méthodes, bien que la zone méthylé puisse être réduite à quelques nucléotides. L’utilisation de différents anticorps spécifiques à la modification permet à MeRIP d’être ajusté pour les différentes modifications de base présentes sur l’ARN, élargissant ainsi les applications possibles de cette méthode.

Un schéma de la méthode est fourni à la figure 1. Les premières étapes critiques du protocole sont d’obtenir un ARN de bonne qualité (RIN ≥ 7) et de le sonifier à environ 100 fragments de nt. L’efficacité des deux étapes est examinée par une machine d’électrophoresis capillaire à base de copeaux. Dans la figure 2A, une course représentative d’un bon échantillon d’ARN est indiquée. L’échantillon est dilué 1:10 avant chargement sur la puce afin d’avoir une concentration qui est dans la gamme de détection du kit utilisé (5-500 ng/μL). Le même échantillon est également exécuté après la sonication et est indiqué dans la figure 2B. Remarquez la présence d’un pic uniforme déplacé vers la gauche du diagramme, à une taille d’environ 100 nucléotides. La concentration plus faible est causée à la fois par la perte d’ARN pendant la fragmentation, mais aussi par l’augmentation du volume des échantillons (60-100 μL, étape 1.7.1).
La qualité des échantillons IP et Mock peut être évaluée par qRT-PCR. À cette fin, les IVT à pointes servent de contrôles positifs et négatifs : l’IVT méthylé, où, dans toutes les positions cytosines il y a m5C, devrait être fortement enrichi dans l’échantillon ip; au contraire, l’IVT non méthylé ne devrait pas avoir de différence entre IP et Mock. Les amorces utilisées dans l’analyse qRT-PCR pour les deux IVTs de contrôle(EGFP et Renilla luciferase) sont répertoriées dans le tableau 1. En effet, comme le montre la figure 3, environ 80 % de l’IVT méthylé a été récupéré dans l’échantillon ip, et seulement environ 2 % dans le Simulacre. Pour le contrôle non méthylé, la récupération a été inférieure à 1 % dans les échantillons IP et Mock. Cela vérifie l’efficacité du MeRIP que les fragments d’ARN méthylés ont été précipités et enrichis, et est un bon indicateur que les échantillons peuvent être utilisés pour l’analyse en aval. En outre, l’enrichissement par pli de l’IVT non méthylé (ip/mock ratio) peut être appliqué comme seuil pour estimer l’importance de l’enrichissement dans les analyses qRT-PCR.
Après avoir aligné les lectures sur le génome (figure 4), les algorithmes d’appel de pointe décrits dans les étapes 3.4.1 et 3.4.2 sont appliqués pour identifier les fenêtres statistiquement significatives, enrichies dans les échantillons de propriété intellectuelle par rapport à l’entrée. Les séquences qui correspondent à ces fenêtres peuvent être utilisées plus loin, par exemple pour rechercher des motifs conservés liés à la méthylation11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole MeRIP-seq. Les échantillons d’ARN sont incubés avec un anticorps pour les cytosines 5 méthylés et les complexes sont abattus avec des perles magnétiques de protéine G qui capturent les anticorps avec l’ARN lié. Les échantillons d’ARN élucidés sont analysés par séquençage profond et qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs de l’analyse de la qualité des échantillons d’ARN. (A) Profil représentatif d’un échantillon de plante arn total qualifié. (B) Profil représentatif d’un échantillon d’ARN après sonication à 100 fragments de nt. Fichiers de sortie à partir d’un logiciel d’électrophoresis capillaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figure 3 : analyse qRT-PCR des IVTs de contrôle. Des transcriptions in vitro méthylées et non méthylés ont été employées comme contrôles positifs et négatifs de l’essai de MeRIP, respectivement. Après immunoprécipice, l’IVT méthylé est fortement enrichi dans l’échantillon ip (vert) mais pas dans l’échantillon Mock (sans anticorps anti-m5C; violet). L’IVT non méthylé n’a montré aucun enrichissement et aucune différence entre IP et Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figure 4 : Lire l’alignement avant et après le MeRIP autour d’une transcription représentative. Lit aligné sur une transcription spécifique dans l’échantillon d’entrée (rangée supérieure) et dans deux répliques IP (rangée moyenne et inférieure). La boîte noire montre une fenêtre enrichie identifiée de 50 nt de long basée sur macs243 et MeRIP-seq22 analyses d’appel de pointe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cible</td>
			<td colspan="2">Paire d’amorce</td>
			<td colspan="2">Séquence de produit</td>
			<td>Longueur du produit</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP (egfp)</td>
			<td colspan="2">Pour: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCCCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGA GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCGCATCGAGGAAGGGC GTGAACCG</td>
			<td rowspan="2">72 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">Pour: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC AGTTA</td>
			<td rowspan="2">75 pb</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Renseignements sur les amorces et les produits générés pour l’analyse qRT-PCR.
Recettes tampons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

Essai méthylé d’immunoprécipation d’ARN pour étudier la modification m5C dans Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.4K vues.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. L’essai méthylé d’immunoprécipitation d’ARN est une méthode anticorps-basée employée pour enrichir pour des fragments méthylés d’ARN. Couplé à un séquençage profond, il conduit à l’identification des transcriptions portant la modification m5C.

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

L&#39;élevage et d&#39;ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Recherche

Génétique

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.