このプロトコルでは、単一のニューロンにおける複数のRNA修飾を同時にプロファイリングできる最初の方法を導入し、個々の細胞における転写後調節を含む新しい研究分野を開きました。最適化されたサンプル調製条件と液体クロマトグラフィータンデム質量分析を活用することで、実験ごとに1ダース以上の修飾ヌクレオシドを1つのニューロンで検出および定量できます。個々の細胞は、その機能、形態、および化学的プロファイルの点で異なる。
これらの細胞の完全な化学モザイク(RNAプロファイルを含む)を測定できることは、健康と病気の両方におけるそれらの違いを理解するのに十分な細胞のために重要です。単一ニューロン単離前の神経節調製の程度は、単離を行う個体の嗜好に依存する。より長いプロテアーゼ治療と短いプロテアーゼ治療の両方を試みて、適切な状態を特定します。
まず、麻酔をかけたAplysia californica腹側を解剖トレイに入れます。1つの鈍い先端を動物に向けて配置し、慎重に足を縦方向に切断して、外科用はさみを使用して解剖を開始します。動物の体の吻側、尾側、および側方の側面を固定して体腔内の内臓および中枢神経系神経節を露出させた後、神経節および神経節に由来するいくつかの接続性を外科的に切断することによって、動物から主要な中枢神経系神経節を単離する。
神経節をストレプトマイセス・グリセウス由来の1ミリリットルプロテアーゼXIV型溶液あたり10ミリグラムに浸し、摂氏34度で30分〜1時間インキュベートする。次に、人工海水抗生物質溶液で神経節を6回すすいでください。次いで、5ミリメートルの開口部に切断されたポリプロピレン転写ピペットを用いて、人工海水抗生物質溶液で満たされたシリコーンポリマーコーティングされた皿にすべての神経節を移す。
神経節は常に人工海水に沈めてください。次に、神経節鞘を取り外すには、神経節を固定し、マイクロハサミと細かい鉗子を使用します。十分に強力な酵素処理では、被覆解除のためにガラスまたは金属の針を使用してください。
関心のあるニューロンを視覚的に識別する。プールされたガラス毛細血管または鋭いタングステン針を使用して、同定された細胞をバルク神経節から慎重に単離する。約1マイクロリットルの人工海水をプラスチックマイクロピペットに吸い込んだ後、単離した細胞を4マイクロリットルの0.365モル酢酸アンモニウムを含むPCRサンプルチューブに移す。
ブランク測定のために、神経節を含む皿から人工海水抗生物質溶液の5マイクロリットルアリコートを収集し、消化緩衝液と混合する。単離されたニューロンを、0.365モル酢酸アンモニウム中のマイクロピペットで吸引および分配を繰り返して溶解する。一部の細胞はすぐに破裂しないことがあります。
それらを溶解するには、プールされたガラスキャピラリーでセルの直径全体に圧力をかけます。次に、3.375マイクロリットルのRNA消化バッファーをサンプルに添加する前に、熱サイクルでサンプルを加熱します。この溶液をマイクロピペットを用いて混合し、溶液を数回引き出して分配する。
PCRチューブの壁に付着した液滴は、ミニチュアベンチトップ遠心分離機を使用してスピンダウンします。次に、37°Cの熱サイクルでサンプルを3時間インキュベートし、続いて加熱された蓋をOn.Onceに設定して10°Cで保持し、サンプルが冷却されたら、直ちに7マイクロリットルの溶液をオートサンプラーチューブに気泡を形成することなく250マイクロリットルのインサートを備えたオートサンプラーバイアルに移します。正準ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドの分離のための液体クロマトグラフィーシステムを調製するには、摂氏 36 度で 12 分間、毎分 0.2 ミリリットルの流速で 99% 移動相 A および 1% 移動相 B を使用して C18 カラムを平衡化します。
質量分析装置をポジティブモードで操作し、ダイバータバルブを分析の最初の2分間は無駄にし、残りの実行ではソースにセットします。次に、110~600のm/z範囲にわたる質量スペクトルを収集します。データベースから構築された好ましい質量リストと0.5の分離ウィンドウを使用して、3秒のサイクルタイムにわたって35〜40電子ボルトで衝突誘起解離するイオンを選択します。
アクティブ除外を使用して、3つのスペクトル後のフラグメンテーションからイオンを除外します。強度が50,000カウント以上50,000カウント未満のイオンの動的MS/MSスペクトル取得を、それぞれ4ヘルツと1ヘルツで設定します。イオン選択の最小閾値を1、990カウントとする。
質量分析による定量的単一ニューロンRNA修飾分析では、修飾ヌクレオシド標準物質について得られた抽出イオンクロマトグラムピーク面積を最低5濃度で抽出して検量線を作成し、未知の内因性分析物濃度の補間を可能にします。質量分析による単一ニューロンRNA修飾分析は、溶解消化およびLC-MS/MS分析のために、同定されたニューロンを少量のサンプルに手動で単離することを含む。質量分析による単一ニューロンRNA修飾解析は、Aplysia californicaの中枢神経系からの単一ニューロンにおける12以上のRNA修飾を日常的に検出し、単一細胞におけるこの動物の既知のエピトランスクリプトームのほぼ半分のカバレッジを表す。
その結果、単一細胞のRNA修飾プロファイルが同じ組織内のバルク細胞から発散する可能性があることが初めて明らかになりました。ユニークな修飾ヌクレオシドパターンのさらなる支持は、単一のニューロンおよびバルク組織の両方で一般的に検出された13のRNA修飾についてペアワイズ比較が行われた動物の別個のコホートから得られた。機能的に異なる細胞におけるRNA修飾は、スコアプロットにおいて固有のクラスターを形成し、相同なR2/LPl1ニューロンは共クラスター化した。
負荷プロットは、差異が主に2'O-メチルアデノシンおよびN1-メチルアデノシンを含むメチルアデノシンの位置異性体の存在量によって駆動されたことを示している。N1-メチルアデノシン、プソイドウリジン、2'O-メチルグアノシン、2'O-メチルアデノシン、およびN6-ジメチルアデノシンについて外部検量線を作成した。そして、中大脳細胞およびR2/LPl1細胞対における各修飾ヌクレオシドの量は、補間によって決定した。
最小量の人工海水が、単一の単離されたニューロンとともにPCRチューブに移されることを確認します。これにより、サンプルの希釈が最小限に抑えられ、最終的に分析物の検出に影響します。このプロトコルは、軸索や樹状突起などの細胞内構造におけるRNA修飾の分布を調査し、活性依存性局所翻訳のメカニズムの理解を深めるために使用することができる。
