Este trabajo fue apoyado por un estipendio de doctorado del IMPRS a E.S, una beca a largo plazo de EMBO a V.P., y fondos internos MPI-MPP a F.K. Parte de este trabajo también se financió a través de PLAMORF, un proyecto que ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de Subvenciones Nº 810131). Los autores quieren agradecer a Federico Apelt el análisis bioinformática y los comentarios sobre el manuscrito, y a Mathieu Bahin y Amira Kramdi por el análisis bioinformática.

1. Preparación del ARN
<ol><li>Moler 200 mg de tejido vegetal a polvo en nitrógeno líquido, asegurándose de que el tejido permanezca congelado durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Extraiga el ARN del tejido vegetal deseado siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo. Para disminuir la posibilidad de contaminar el ARN con ADN durante la separación por fases, utilice 1-bromo-3-cloropropano en lugar de cloroformo.<ol>
<li>Añadir 1 ml de reactivo de extracción de ARN que contiene tiocyanato de guanidina y fenol ácido al tejido vegetal moliado (500 μL por 100 mg de tejido). Mezcle bien invirtiendo y asegúrese de que todo el tejido esté mojado. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar los complejos ribonucleoprotein.</li>
		<li>Centrífuga durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reactivo de extracción de ARN) y vórtice vigorosamente.</li>
		<li>Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C y transferir la fase acuosa superior (aprox. 500 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 1 volumen de isopropanol (500 μL) y 0,1 volumen de acetato de sodio de 3 M pH 5,5 (50 μL), mezclar bien invirtiendo y precipitar 10 min a -20 °C. NOTA: Se recomienda el uso de acetato de sodio (NaOAc) con el fin de mejorar la precipitación de ARN. El protocolo se puede pausar en este punto prolongando la precipitación de ARN durante unas horas o incluso durante la noche.</li>
		<li>Centrífuga durante 30 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lave el pellet dos veces con 500 μL del 80% de EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche.</li>
		<li>Lave el pellet una vez con 500 μL 99% EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche.</li>
		<li>Seque el pellet durante 5-10 min y disuelva en 30 μL de H2O sin RNase. NOTA: En su lugar, utilice cualquier protocolo de extracción de ARN de elección (por ejemplo, un sistema basado en columnas). Si se incluye una digestión DNase en el protocolo, omitala en el paso siguiente (paso 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la concentración de ARN (por ejemplo, con el uso de un espectrofotómetro) y digiera 20 μg de ARN con DNase. NOTA: El ADN es rico en m5C y el anticuerpo no distingue entre ADN y ARN.<ol>
<li>En una reacción típica de DNase, trate 10 μg de ARN en una reacción de 50 μL. Mezcle los siguientes componentes e incuba las reacciones a 37 °C durante 30 min: 10 μg de ARN x μL 10x Tampón DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unidades) RNase-free H2O hasta 50 μL</li>
		<li>Retire la enzima añadiendo un volumen adecuado de reactivo de inactivación DNase (si está incluido en el kit DNase y de acuerdo con las instrucciones del fabricante) o realizando un paso de limpieza (por ejemplo, purificación de columnas o extracción de fenol/cloroformo).</li>
	</ol></li>
	<li>Compruebe la calidad y pureza del ARN aislado mediante electroforesis capilar y proceda si el número de integridad del ARN (RIN) es superior a 7, para asegurarse de que las muestras son de buena calidad.</li>
	<li>OPCIONAL: Retire el ARN ribosomal para enriquecer las muestras en contenido de ARNm utilizando un kit de eliminación de ARN y de acuerdo con el protocolo del fabricante.<ol>
<li>Utilice el ARN tratado DNase del paso anterior para las reacciones de agotamiento del ARN. Realice reacciones múltiples si la cantidad de ARN total es mayor que la cantidad máxima sugerida para la reacción.</li>
		<li>Tenga en cuenta que sólo el 5-10% de la cantidad de entrada se recuperará después del agotamiento del ARN. Proceda con el ARN agotado rRNA (cantidad igual para todas las muestras) e ignore las cantidades mencionadas en los pasos siguientes, ya que se refieren al ARN total. NOTA: Para una comparación y descripción de los métodos de agotamiento de rRNA disponibles, consulte las referencias 38,39,40. rRNA es la mayor parte del ARN total y es m5C metilado en muchos organismos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar previamente transcripciones in vitro (IVT) para ser utilizadas como secuencias de ARN de control y agregarlas en las muestras.<ol>
<li>Producir dos ICT distintos utilizando un kit de transcripción in vitro, uno con nucleósidos no metilados y otro donde rCTP es reemplazado por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos y positivos en MeRIP, respectivamente. Las transcripciones preparadas fueron las de EGFP y Renilla luciferase. NOTA: Los IVT no deben existir en el transcriptoma del organismo que está analizando. Si los IVT son de la misma plantilla (por ejemplo, ambos EGFP), agregue el control positivo y negativo en dos muestras diferentes. Si su secuencia es diferente (por ejemplo, EGFP y Renilla), se pueden agregar a la misma muestra.</li>
		<li>Pico en cada muestra 0,1 ng IVT por 3 μg de ARN, como controles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar el ARN a aproximadamente 100 nt fragmentos. NOTA: Las condiciones para la cizallamiento de ARN deben ajustarse de antemano y difieren para cada sonicator. Para el modelo utilizado aquí, la sonicación se realiza con las siguientes condiciones: Potencia máxima 174, Factor de servicio 10, Ciclos/ráfaga 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate la misma cantidad de ARN para todas las muestras, al menos 12 μg de ARN por muestra en 80 μL de volumen total (mín. 60 μL, máx. 100 μL), lleno de RNase-free H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme la eficiencia de la sonicación y la concentración de las muestras de ARN por electroforesis capilar. El tamaño promedio del ARN fragmentado debe ser de alrededor de 100 nt.</li>
</ol>2. Inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP)
<ol><li>En los tubos de baja unión, añadir 9 μg de ARN sonicado y RNase-free H2O hasta 60 μL (o más, dependiendo de la concentración).</li>
	<li>Disociar las estructuras secundarias calentando el ARN a 70 °C en un baño de agua durante 10 minutos y enfriándose durante 10 minutos adicionales en una mezcla de agua helada.</li>
	<li>Divida la muestra en tres partes: un tercio (20 μL, si se tomaron 60 μL en el paso 2.1) se guarda en un tubo separado a -80 °C como muestra de entrada. Llene los 40 μL restantes con RNase-free H2O hasta 860 μL y luego divida en dos tubos de baja unión: uno para IP y otro para el control Mock (430 μL cada uno).</li>
	<li>Añadir a ambos tubos: 50 μL de tampón MeRIP de 10x 10 μL de inhibidor de la RNase 10 μL de anticuerpo α-m5C (10 μg) en la muestra IP por 10 μL de H2O en la muestra Simulada NOTA: El clon de anticuerpos utilizado anteriormente ya no está disponible comercialmente. Sin embargo, cualquier anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina debe funcionar de manera similar. Los anticuerpos deben hacerse la prueba de especificidad antes de utilizarse para MeRIP11,23.</li>
	<li>Sella los tubos con parafilm e incuba durante 12-14 horas a 4 °C, con rotación aérea.</li>
	<li>Al día siguiente, prepare las cuentas magnéticas G proteicas para la unión.<ol>
<li>Para cada tubo (ip o control simulado), utilice 40 μL de cuentas. Añadir la cantidad total de cuentas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, para 2 muestras IP y 2 Mock, se necesitan 160 μL de cuentas) en un tubo de 15 ml y lavar tres veces con 800 μL de búfer MeRIP 1x por muestra (# de tubos x 800 μL buffer, por ejemplo, 3.2 mL para 2 muestras IP y 2 Mock).</li>
		<li>Realice lavados a temperatura ambiente durante 5 minutos con rotación aérea, recoja las cuentas con la ayuda de un bastidor magnético y deseche el búfer de lavado. Después del tercer lavado, resuspend las cuentas en el mismo volumen de 1x buffer MeRIP que el volumen inicial de cuentas tomadas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, 160 μL de 1x búfer MeRIP para 2 muestras IP y 2 Mock). NOTA: La cantidad de cuentas G proteicas utilizadas está determinada por la capacidad de unión de las cuentas para el tipo de anticuerpo específico y la cantidad de anticuerpos utilizados. En este caso, las cuentas tienen una capacidad de unión de aprox. 8 μg de ratón IgG por mg de cuentas y 30 mg/mL de concentración. Por lo tanto, 40 μL son suficientes para unir aprox. 9,6 μg de anticuerpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 40 μL de cuentas resuspendidas a cada muestra IP y Mock e incubar durante 2 horas adicionales a 4 °C, con rotación de sobrecarga.</li>
	<li>Coloque los tubos en un bastidor magnético durante 1 minuto y deseche el sobrenadante o guárdelo como control (muestra de ARN no enlazada).</li>
	<li>Lave las cuentas 5 veces resuspending en 700 μL de 1x buffer MeRIP suministrado con 0.01% Tween 20 e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación aérea.</li>
	<li>Resuspend las cuentas lavadas en 200 μL de tampón de digestión Proteinase K y añadir 3,5 μL de Proteinase K. Incubar durante 3 horas a 50 °C, temblando a 800 rpm. Ocasionalmente, deslice manualmente la parte inferior del tubo si se está formando un sedimento de cuentas durante la incubación.</li>
	<li>Extraiga el ARN mediante la adición de 800 μL de reactivo de extracción de ARN y siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo, y continúe como en el paso 1.2. Para aumentar la visibilidad del pellet de ARN, se puede añadir un co-precipitante de color en isopropanol en el paso de precipitación. Resuspend el pellet en 20 μL de RNase-free H2O (o igual al volumen de entrada mantenido en el paso 2.3).</li>
</ol>3. Análisis descendente
<ol><li>Envíe las muestras de entrada e IP para la secuenciación de un solo extremo con 50 bases de longitud de lectura (SE50).</li>
	<li>Recorta 3' los adaptadores finales usando cutadapt41 y descarta lecturas que son más cortas que 48 nt.</li>
	<li>Mapa recortado lee al genoma arabidopsis (anotación TAIR10) utilizando STAR42 con un límite del 6% para desajustes y tamaño máximo de intron de 10 kb. Mantenga las lecturas asignadas de forma única para su posterior análisis.</li>
	<li>Identifique fragmentos de ARN enriquecidos en muestras IP en comparación con Input utilizando dos métodos distintos y considere los que ambos encuentran significativamente enriquecidos.<ol>
<li>Primero, detecte los picos MeRIP-seq usando el llamador máximo MACS243 en las direcciones IP agrupadas versus la entrada.</li>
		<li>En segundo lugar, siga el análisis de las llamadas de pico MeRIP-seq como se describe en Meyer et al.22 y Yang et al.17.<ol>
<li>Usando scripts R personalizados, divida el genoma en ventanas distintas de 25 nt y cuente el número de lecturas asignadas de forma única para cada ventana en función de la posición del último nucleótido asignado (ya que las lecturas se originan a partir de fragmentos de ARN de 100 nt).</li>
			<li>Calcule ventanas significativamente enriquecidas en muestras IP en comparación con Entrada con la prueba exacta de Fisher.</li>
			<li>Mantenga los picos significativamente enriquecidos que se extienden por al menos dos ventanas consecutivas y deseche picos que cubran solo una ventana.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique las regiones anotadas del genoma (transcripciones) con picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos métodos.</li>
	<li>Alternativamente o de forma complementaria, pruebe objetivos específicos de ARN para su enriquecimiento en las muestras ip.<ol>
<li>Transcriba inverso el ARN (mismo volumen de muestras de entrada, IP y simulación) con hexameros aleatorios.</li>
		<li>Realice PCR cuantitativo en tiempo real en los objetivos elegidos, comparando entrada, IP y simulación a través del método ΔΔCt. NOTA: El producto generado no debe ser superior a 100 bp, ya que este es el tamaño medio de fragmentación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El ARN lleva más de cien modificaciones de base distintas4 que forman el epitranscriptome44. Estas modificaciones añaden una capa adicional de regulación de la traducción y la señalización (revisada en5,6,8,20,45,46). Los primeros estudios fueron capaces de detectar la presencia de modificaciones post-transcripcionales en ARN28,47, pero los ARN modificados específicos necesitan ser identificados con el fin de entender el papel de la epitranscriptomica. MeRIP fue diseñado como un método para mapear sitios de metilación de ARN de todo el mundo21,22. Se puede adaptar a cualquier modificación, si hay un anticuerpo específico disponible.
La principal fortaleza de este protocolo es que es relativamente simple, seguro para el ARN y el usuario (por ejemplo, 5-azaC es altamente tóxico para las plantas y los seres humanos) y no requiere información de secuencia o modificación de enzimas. Además, el enriquecimiento de ARN metilados por la P.I. aumenta las posibilidades de que se detecten mRNAs de baja abundancia, a diferencia de la secuenciación de bisulfitos que no contiene un paso de enriquecimiento. Cuando se realizan dos rondas serie de MeRIP, el enriquecimiento en fragmentos de ARN que contienen sitios de metilación aumenta aún más22. Una de las limitaciones de MeRIP, especialmente cuando se aplica a estudios de metilación de ARNm, es la alta cantidad de ARN requerida como entrada para el ensayo. El paso de ribodepleción – o poli(A) – reducirá el fondo causado por el ARN ribosomal fuertemente modificado, pero elimina más del 90% del ARN total. El ADN también debe eliminarse por completo, ya que es rico en citosinas metiladas de 5. Otro inconveniente es la menor resolución de la posición exacta de la metilación. La sonicación del ARN antes de la incubación con el anticuerpo ayuda a esta dirección al reducir la región que contiene la modificación a 100-200 nucleótidos. Cuando MeRIP se combina con secuenciación profunda, la resolución de la predicción del sitio m5C aumenta a medida que la secuenciación lee formar una distribución gaussiana alrededor del sitio potencial de metilación. Además, la especificidad del anticuerpo debe confirmarse antes del ensayo (por ejemplo, con ensayos de manchas de puntos de ARN, realizados con oligos sintetizados con nucleótidos modificados), sin embargo, hasta qué punto un anticuerpo puede distinguir realmente entre modificaciones estrechamente relacionadas (por ejemplo, m6A y m6Am) es un punto de discusión en el campo48,49. Además, los ARN altamente estructurados podrían interferir con la interacción anticuerpo-antígeno, otra restricción que se aborda principalmente con la fragmentación y desnaturalización del ARN antes de la P.I. Por el contrario, la secuenciación de bisulfitos que también se ve afectada por estructuras secundarias, no incluye un paso de fragmentación y esta podría ser una razón que causa discrepancia entre los sitiosm5C y los mRNAs predichos por la secuenciación de bisulfitos16 y MeRIP-seq11,17. Otras modificaciones de la citosina (por ejemplo, hm5C) también son resistentes a la deaminación mediada por bisulfito35.
Las modificaciones de MeRIP-seq incluyen un paso de enlace cruzado, ya sea con la introducción de un ribonucleoside fotoactivatable (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50)o utilizando luz UV para crear enlaces cruzados anticuerpo-ARN después de la IP (miCLIP49,método diferente al miCLIP descrito en la introducción30,pero también con resolución de nucleótidos individuales). En el futuro, y a medida que se acumule conocimiento sobre la metilación del ARN, podrían ser preferibles enfoques más específicos, basados en las enzimas modificadoras y/o en las secuencias de consenso donde aparece la metilación. La identificación de las proteínas lectoras es esencial para la comprensión de la función molecular y de señalización de las modificaciones post-transcripcionales. La tecnología de secuenciación nanopore ya permite la identificación directa de nucleótidos modificados sin tratamiento previo del ARN17, pero todavía hay margen de mejora en este campo con respecto a la profundidad de secuencia y el análisis bioinformática. En general, MeRIP-seq es actualmente un enfoque establecido, confiable e imparcial para identificar transcripciones de ARN metiladas.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

En los tres reinos de la vida, las especies de ARN se someten a modificaciones post-transcripcionales y la investigación sobre estas modificaciones bioquímicas funcionalmente relevantes se llama "epitranscriptomics". La epitranscriptomics es un campo en crecimiento y se están desarrollando varios métodos para estudiar y mapear las modificaciones en moléculas de ARN (revisadas en1,2). Se han encontrado más de un centenar de modificaciones de ARN, detectadas en arneses, tRNAs, otros nRNAs, así como arneses3,4. Aunque la presencia y función de modificaciones post-transcripcionales químicamente diversas en tRNAs y ARN se estudian extensamente5,6,7,8, sólo recientemente se han caracterizado modificaciones del ARNM. En las plantas, se han identificado muchas modificaciones de ARNm hasta la fecha, incluyendo m7G en la estructura de la tapa9,m1A10,hm5C11,12,y uridilación13. Sin embargo, sólo m6A10,14,15,m5C11,16,17,y pseudouridina18 han sido mapeados en todo el transcriptoma en Arabidopsis. Las modificaciones de la base del ARNm post-transcripcional están involucradas en varios procesos de desarrollo19,20.
Uno de los enfoques más utilizados en la epitranscriptomicidad es la inmunoprecipitación de ARN metilada junto con la secuenciación profunda (MeRIP-seq). MeRIP-seq fue desarrollado en 2012 para estudiar m6A en células de mamíferos21,22. Requiere el uso de un anticuerpo para la modificación deseada y tiene como objetivo enriquecer para los fragmentos de ARN que llevan los nucleótidos modificados. Por lo general, es seguido por secuenciación profunda para identificar y mapear los fragmentos enriquecidos o PCR cuantitativo para verificar objetivos específicos de ARN. La precisión de MeRIP se basa en la especificidad del anticuerpo para reconocer el nucleótido modificado sobre modificaciones similares (por ejemplo, m5C y hm5C11,23). Además delm6A, MeRIP-seq también se ha aplicado para estudiar metilación de ARNm1A y m5C en varios organismos11,17,23,24,25.
La metilación de la citosina en la quinta posición de carbono (m5C) es la modificación de ADN más prevalente26,27 y una de las modificaciones de ARN más comunes también3,4. Mientras que m5C fue detectado en mRNAs eucariota en 197528, sólo recientemente tienen estudios centrados en mapear la modificación en todo el transcriptoma, en codificación y no codificación RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Los métodos alternativos utilizados en la investigación de ARN m5C incluyen la conversión química de citosinas no metiladas en uracils (secuenciación de bisulfito) y ensayos de inmunoprecipitación basados en una unión irreversible de una metiltransferasa de citosina de ARN conocida a sus objetivos de ARN (miCLIP, aza-IP). En resumen, la secuenciación de bisulfito explota la característica de la citosina metilada de 5 para ser resistente al tratamiento con bisulfito de sodio que deamina citostinas nomodificadas a uracil. El método fue desarrollado por primera vez para el ADN, pero adaptado para arn también y muchos estudios han elegido este enfoque para detectar sitios m5C en ARN16,23,29,32,34,35. Tanto miCLIP como aza-IP requieren conocimientos previos de la citosina de ARN metiltransferasa y el uso del anticuerpo respectivo. En el caso de miCLIP (metilación individual-nucleótida-resolución de enlace e inmunoprecipitación), la metiltransferasa lleva una sola mutación de aminoácidos para que se una al sustrato de ARN pero no se puede liberar30. En aza-IP (inmunoprecipitación de ARN mediada en 5 azacitadina), la unión irreversible se forma entre el nucleósido de 5 azaC y la arnesina metiltransferasa cuando la 5-azaC proporcionada exógenamente es incorporada por las polimerasas de ARN en una molécula de ARN objetivo31.
La principal ventaja de estos tres métodos es que permiten la asignación de resolución de nucleótidos únicos de m5C. Además, miCLIP y aza-IP proporcionan información sobre los objetivos específicos de una citosina de arnesa metiltransferasa seleccionada, descifrando más profundamente el mecanismo y el papel de las modificaciones post-transcripcionales del ARN. Sin embargo, el enfoque MeRIP-seq puede identificar regionesm5C de todo el transcriptoma sin ningún conocimiento previo requerido y evita condiciones químicas y de temperatura duras, como el tratamiento de bisulfitos o la incubación con 5-azaC. La secuenciación de merip y bisulfito puede ser inhibida por las estructuras secundarias de ARN36. El paso de fragmentación que se incluye en el ensayo MeRIP antes de la inmunoprecipitación tiene como objetivo facilitar la unión de anticuerpos y aumentar la resolución de la identificación m5C.
Otro método que vale la pena mencionar es la espectrometría de masas (EM) de nucleósidos de ARN. La EM puede detectar y distinguir cualquier tipo de modificación tanto en el ADN como en el ARN. Brevemente, el ARN se extrae y DNase digiere, luego se desala y digiere a nucleósidos individuales. Los nucleósidos de ARN son analizados por un espectrómetro de masas. Este método se puede utilizar para cuantificar los niveles de cada modificación y no se basa en un anticuerpo o una conversión química. Sin embargo, un inconveniente importante es que proporciona información masiva sobre la presencia de modificaciones de ARN. Para mapear las modificaciones, la EM debe combinarse con la información de digestión y secuenciación de RNase sobre moléculas específicas de ARN, como en el caso del tRNALeuhumano (CAA)37.
Aquí, describimos y discutimos el ensayo MeRIP tal como se utiliza para estudiar la metilación de ARN m5C en Arabidopsis17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;&#8208;m5C antibody</td>
			<td>ZymoResearch</td>
			<td>A3001 (discontinued), A3002 available</td>
			<td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA 6000 Nano kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>TURBO DNA-free kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-precipitant of nucleic acids</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Glycoblue, 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-binding reaction tubes</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>G017</td>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>RNasin Plus 40 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rRNA removal kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RZPL11016</td>
			<td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication tubes</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis machine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>2100 Bioanalyzer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>5417R model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>R4040</td>
			<td>RotoBot Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td>S220 Focused-ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>NanoDrop OneC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1012</td>
			<td>1012 Incubation bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Las modificaciones de base secundarias en el ARN, como m5C, afectan a la estructura y función de las moléculas modificadas de ARN. Inmunoprecipitación y secuenciación de ARN metilado (MeRIP-seq) es un método que tiene como objetivo enriquecer el ARN metilado y, en última instancia, identificar transcripciones modificadas. Brevemente, el ARN sonicado se incuba con un anticuerpo para citosinas metiladas de 5 y se precipita con la ayuda de cuentas G proteicas. A continuación, los fragmentos enriquecidos se secuencian y los sitios potenciales de metilación se asignan en función de la distribución de las lecturas y la detección de picos. MeRIP se puede aplicar a cualquier organismo, ya que no requiere ninguna secuencia previa o modificar el conocimiento enzimático. Además, además de la fragmentación, el ARN no se somete a ningún otro tratamiento químico o de temperatura. Sin embargo, MeRIP-seq no proporciona predicción de nucleótidos únicos del sitio de metilación como otros métodos, aunque el área metilada se puede reducir a unos pocos nucleótidos. El uso de diferentes anticuerpos específicos de modificación permite ajustar MeRIP para las diferentes modificaciones de base presentes en el ARN, ampliando las posibles aplicaciones de este método.

Se proporciona un esquema del método en la figura 1. Los primeros pasos críticos del protocolo son obtener ARN de buena calidad (RIN ≥ 7) y sonicarlo a aproximadamente fragmentos de 100 nt. La eficiencia de ambos pasos es examinada por una máquina de electroforesis capilar a base de virutas. En la Figura 2A, se muestra una ejecución representativa de una buena muestra de ARN. La muestra se diluye 1:10 antes de cargar en el chip con el fin de tener una concentración que está en el rango de detección del kit utilizado (5-500 ng / μL). El mismo ejemplo también se ejecuta después de la sonicación y se muestra en la figura 2B. Observe la presencia de un pico uniforme desplazado a la izquierda del diagrama, a un tamaño de alrededor de 100 nucleótidos. La menor concentración se debe tanto a la pérdida de ARN durante la fragmentación como al aumento del volumen de las muestras (60-100 μL, paso 1.7.1).
La calidad de las muestras IP y Mock se puede evaluar mediante qRT-PCR. Con este fin, los IVT con picos sirven como controles positivos y negativos: se espera que la IVT metilada, donde en todas las posiciones de citosina hay m5C, se enriquezca en gran medida en la muestra ip; por el contrario, la IVT no metilada no debería tener una diferencia entre IP y Mock. Las imprimaciones utilizadas en el ensayo qRT-PCR para los dos IVT de control(EGFP y Renilla luciferase) se enumeran en el cuadro 1. De hecho, como se muestra en la Figura 3, alrededor del 80% del IVT metilado se recuperó en la muestra IP, y sólo aproximadamente el 2% en el Simulado. Para el control no metilado, la recuperación fue inferior al 1% tanto en muestras IP como simuladas. Esto verifica la eficiencia de MeRIP que los fragmentos de ARN metilados fueron precipitados y enriquecidos, y es un buen indicador de que las muestras se pueden utilizar para el análisis posterior. Además, el enriquecimiento plegable de la IVT no metilada (relación IP-Simulado) puede aplicarse como umbral para estimar la importancia del enriquecimiento en los ensayos qRT-PCR.
Después de alinear las lecturas con el genoma (Figura 4), los algoritmos de llamada máxima descritos en los pasos 3.4.1 y 3.4.2 se aplican para identificar las ventanas estadísticamente significativas, enriquecidas en las muestras IP en comparación con la entrada. Las secuencias que corresponden a estas ventanas se pueden utilizar más, por ejemplo, para buscar motivos relacionados con la metilación conservados11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo MeRIP-seq. Las muestras de ARN se incuban con un anticuerpo para citosinas metiladas con 5 y los complejos se extraen con cuentas magnéticas G proteicas que capturan los anticuerpos junto con el ARN unido. Las muestras de ARN eluted son analizadas por secuenciación profunda y qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos del análisis de calidad de muestras de ARN. (A) Perfil representativo de una muestra total cualificada de la planta de ARN. (B) Perfil representativo de una muestra de ARN después de la sonicación a fragmentos de 100 nt. Archivos de salida del software de electroforesis capilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: análisis qRT-PCR de los IVT de control. Las transcripciones in vitro metiladas y no metiladas se utilizaron como controles positivos y negativos del ensayo MeRIP, respectivamente. Después de la inmunoprecipitación, el IVT metilado está altamente enriquecido en la muestra IP (verde) pero no en la muestra Simulada (sin anticuerpo anti-m5C; púrpura). El IVT no metilado no mostró ningún enriquecimiento ni diferencia entre IP y Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Lea la alineación antes y después de MeRIP alrededor de una transcripción representativa. Lee alineado con una transcripción específica en el ejemplo entrada (fila superior) y en dos réplicas IP (fila central e inferior). La caja negra muestra una ventana enriquecida identificada de 50 nt de largo basada en macs243 y meRIP-seq22 análisis de alta llamada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Objetivo</td>
			<td colspan="2">Primer par</td>
			<td colspan="2">Secuencia de productos</td>
			<td>Longitud del producto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferasa</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Información sobre las imprimaciones y los productos generados para el análisis qRT-PCR.
Recetas de búfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m5C en Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.4K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Investigación

Genética

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...