Name: methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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Este trabajo fue apoyado por un estipendio de doctorado del IMPRS a E.S, una beca a largo plazo de EMBO a V.P., y fondos internos MPI-MPP a F.K. Parte de este trabajo también se financió a través de PLAMORF, un proyecto que ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de Subvenciones Nº 810131). Los autores quieren agradecer a Federico Apelt el análisis bioinformática y los comentarios sobre el manuscrito, y a Mathieu Bahin y Amira Kramdi por el análisis bioinformática.

1. Preparación del ARN
<ol><li>Moler 200 mg de tejido vegetal a polvo en nitrógeno líquido, asegurándose de que el tejido permanezca congelado durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Extraiga el ARN del tejido vegetal deseado siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo. Para disminuir la posibilidad de contaminar el ARN con ADN durante la separación por fases, utilice 1-bromo-3-cloropropano en lugar de cloroformo.<ol>
<li>Añadir 1 ml de reactivo de extracción de ARN que contiene tiocyanato de guanidina y fenol ácido al tejido vegetal moliado (500 μL por 100 mg de tejido). Mezcle bien invirtiendo y asegúrese de que todo el tejido esté mojado. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar los complejos ribonucleoprotein.</li>
		<li>Centrífuga durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 200 μL de 1-bromo-3-cloropropano (100 μL por 500 μL reactivo de extracción de ARN) y vórtice vigorosamente.</li>
		<li>Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C y transferir la fase acuosa superior (aprox. 500 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 1 volumen de isopropanol (500 μL) y 0,1 volumen de acetato de sodio de 3 M pH 5,5 (50 μL), mezclar bien invirtiendo y precipitar 10 min a -20 °C. NOTA: Se recomienda el uso de acetato de sodio (NaOAc) con el fin de mejorar la precipitación de ARN. El protocolo se puede pausar en este punto prolongando la precipitación de ARN durante unas horas o incluso durante la noche.</li>
		<li>Centrífuga durante 30 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lave el pellet dos veces con 500 μL del 80% de EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche.</li>
		<li>Lave el pellet una vez con 500 μL 99% EtOH, centrífuga durante 5 min a 12.000 x g a 4 °C y deseche.</li>
		<li>Seque el pellet durante 5-10 min y disuelva en 30 μL de H2O sin RNase. NOTA: En su lugar, utilice cualquier protocolo de extracción de ARN de elección (por ejemplo, un sistema basado en columnas). Si se incluye una digestión DNase en el protocolo, omitala en el paso siguiente (paso 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la concentración de ARN (por ejemplo, con el uso de un espectrofotómetro) y digiera 20 μg de ARN con DNase. NOTA: El ADN es rico en m5C y el anticuerpo no distingue entre ADN y ARN.<ol>
<li>En una reacción típica de DNase, trate 10 μg de ARN en una reacción de 50 μL. Mezcle los siguientes componentes e incuba las reacciones a 37 °C durante 30 min: 10 μg de ARN x μL 10x Tampón DNase 5 μL DNase 1 μL (2 unidades) RNase-free H2O hasta 50 μL</li>
		<li>Retire la enzima añadiendo un volumen adecuado de reactivo de inactivación DNase (si está incluido en el kit DNase y de acuerdo con las instrucciones del fabricante) o realizando un paso de limpieza (por ejemplo, purificación de columnas o extracción de fenol/cloroformo).</li>
	</ol></li>
	<li>Compruebe la calidad y pureza del ARN aislado mediante electroforesis capilar y proceda si el número de integridad del ARN (RIN) es superior a 7, para asegurarse de que las muestras son de buena calidad.</li>
	<li>OPCIONAL: Retire el ARN ribosomal para enriquecer las muestras en contenido de ARNm utilizando un kit de eliminación de ARN y de acuerdo con el protocolo del fabricante.<ol>
<li>Utilice el ARN tratado DNase del paso anterior para las reacciones de agotamiento del ARN. Realice reacciones múltiples si la cantidad de ARN total es mayor que la cantidad máxima sugerida para la reacción.</li>
		<li>Tenga en cuenta que sólo el 5-10% de la cantidad de entrada se recuperará después del agotamiento del ARN. Proceda con el ARN agotado rRNA (cantidad igual para todas las muestras) e ignore las cantidades mencionadas en los pasos siguientes, ya que se refieren al ARN total. NOTA: Para una comparación y descripción de los métodos de agotamiento de rRNA disponibles, consulte las referencias 38,39,40. rRNA es la mayor parte del ARN total y es m5C metilado en muchos organismos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar previamente transcripciones in vitro (IVT) para ser utilizadas como secuencias de ARN de control y agregarlas en las muestras.<ol>
<li>Producir dos ICT distintos utilizando un kit de transcripción in vitro, uno con nucleósidos no metilados y otro donde rCTP es reemplazado por 5-metil-rCTP, para servir como controles negativos y positivos en MeRIP, respectivamente. Las transcripciones preparadas fueron las de EGFP y Renilla luciferase. NOTA: Los IVT no deben existir en el transcriptoma del organismo que está analizando. Si los IVT son de la misma plantilla (por ejemplo, ambos EGFP), agregue el control positivo y negativo en dos muestras diferentes. Si su secuencia es diferente (por ejemplo, EGFP y Renilla), se pueden agregar a la misma muestra.</li>
		<li>Pico en cada muestra 0,1 ng IVT por 3 μg de ARN, como controles.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar el ARN a aproximadamente 100 nt fragmentos. NOTA: Las condiciones para la cizallamiento de ARN deben ajustarse de antemano y difieren para cada sonicator. Para el modelo utilizado aquí, la sonicación se realiza con las siguientes condiciones: Potencia máxima 174, Factor de servicio 10, Ciclos/ráfaga 200, 17 min.<ol>
<li>Sonicate la misma cantidad de ARN para todas las muestras, al menos 12 μg de ARN por muestra en 80 μL de volumen total (mín. 60 μL, máx. 100 μL), lleno de RNase-free H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirme la eficiencia de la sonicación y la concentración de las muestras de ARN por electroforesis capilar. El tamaño promedio del ARN fragmentado debe ser de alrededor de 100 nt.</li>
</ol>2. Inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP)
<ol><li>En los tubos de baja unión, añadir 9 μg de ARN sonicado y RNase-free H2O hasta 60 μL (o más, dependiendo de la concentración).</li>
	<li>Disociar las estructuras secundarias calentando el ARN a 70 °C en un baño de agua durante 10 minutos y enfriándose durante 10 minutos adicionales en una mezcla de agua helada.</li>
	<li>Divida la muestra en tres partes: un tercio (20 μL, si se tomaron 60 μL en el paso 2.1) se guarda en un tubo separado a -80 °C como muestra de entrada. Llene los 40 μL restantes con RNase-free H2O hasta 860 μL y luego divida en dos tubos de baja unión: uno para IP y otro para el control Mock (430 μL cada uno).</li>
	<li>Añadir a ambos tubos: 50 μL de tampón MeRIP de 10x 10 μL de inhibidor de la RNase 10 μL de anticuerpo α-m5C (10 μg) en la muestra IP por 10 μL de H2O en la muestra Simulada NOTA: El clon de anticuerpos utilizado anteriormente ya no está disponible comercialmente. Sin embargo, cualquier anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina debe funcionar de manera similar. Los anticuerpos deben hacerse la prueba de especificidad antes de utilizarse para MeRIP11,23.</li>
	<li>Sella los tubos con parafilm e incuba durante 12-14 horas a 4 °C, con rotación aérea.</li>
	<li>Al día siguiente, prepare las cuentas magnéticas G proteicas para la unión.<ol>
<li>Para cada tubo (ip o control simulado), utilice 40 μL de cuentas. Añadir la cantidad total de cuentas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, para 2 muestras IP y 2 Mock, se necesitan 160 μL de cuentas) en un tubo de 15 ml y lavar tres veces con 800 μL de búfer MeRIP 1x por muestra (# de tubos x 800 μL buffer, por ejemplo, 3.2 mL para 2 muestras IP y 2 Mock).</li>
		<li>Realice lavados a temperatura ambiente durante 5 minutos con rotación aérea, recoja las cuentas con la ayuda de un bastidor magnético y deseche el búfer de lavado. Después del tercer lavado, resuspend las cuentas en el mismo volumen de 1x buffer MeRIP que el volumen inicial de cuentas tomadas (# de tubos x 40 μL, por ejemplo, 160 μL de 1x búfer MeRIP para 2 muestras IP y 2 Mock). NOTA: La cantidad de cuentas G proteicas utilizadas está determinada por la capacidad de unión de las cuentas para el tipo de anticuerpo específico y la cantidad de anticuerpos utilizados. En este caso, las cuentas tienen una capacidad de unión de aprox. 8 μg de ratón IgG por mg de cuentas y 30 mg/mL de concentración. Por lo tanto, 40 μL son suficientes para unir aprox. 9,6 μg de anticuerpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 40 μL de cuentas resuspendidas a cada muestra IP y Mock e incubar durante 2 horas adicionales a 4 °C, con rotación de sobrecarga.</li>
	<li>Coloque los tubos en un bastidor magnético durante 1 minuto y deseche el sobrenadante o guárdelo como control (muestra de ARN no enlazada).</li>
	<li>Lave las cuentas 5 veces resuspending en 700 μL de 1x buffer MeRIP suministrado con 0.01% Tween 20 e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación aérea.</li>
	<li>Resuspend las cuentas lavadas en 200 μL de tampón de digestión Proteinase K y añadir 3,5 μL de Proteinase K. Incubar durante 3 horas a 50 °C, temblando a 800 rpm. Ocasionalmente, deslice manualmente la parte inferior del tubo si se está formando un sedimento de cuentas durante la incubación.</li>
	<li>Extraiga el ARN mediante la adición de 800 μL de reactivo de extracción de ARN y siguiendo un protocolo de extracción de tiocyanato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo, y continúe como en el paso 1.2. Para aumentar la visibilidad del pellet de ARN, se puede añadir un co-precipitante de color en isopropanol en el paso de precipitación. Resuspend el pellet en 20 μL de RNase-free H2O (o igual al volumen de entrada mantenido en el paso 2.3).</li>
</ol>3. Análisis descendente
<ol><li>Envíe las muestras de entrada e IP para la secuenciación de un solo extremo con 50 bases de longitud de lectura (SE50).</li>
	<li>Recorta 3' los adaptadores finales usando cutadapt41 y descarta lecturas que son más cortas que 48 nt.</li>
	<li>Mapa recortado lee al genoma arabidopsis (anotación TAIR10) utilizando STAR42 con un límite del 6% para desajustes y tamaño máximo de intron de 10 kb. Mantenga las lecturas asignadas de forma única para su posterior análisis.</li>
	<li>Identifique fragmentos de ARN enriquecidos en muestras IP en comparación con Input utilizando dos métodos distintos y considere los que ambos encuentran significativamente enriquecidos.<ol>
<li>Primero, detecte los picos MeRIP-seq usando el llamador máximo MACS243 en las direcciones IP agrupadas versus la entrada.</li>
		<li>En segundo lugar, siga el análisis de las llamadas de pico MeRIP-seq como se describe en Meyer et al.22 y Yang et al.17.<ol>
<li>Usando scripts R personalizados, divida el genoma en ventanas distintas de 25 nt y cuente el número de lecturas asignadas de forma única para cada ventana en función de la posición del último nucleótido asignado (ya que las lecturas se originan a partir de fragmentos de ARN de 100 nt).</li>
			<li>Calcule ventanas significativamente enriquecidas en muestras IP en comparación con Entrada con la prueba exacta de Fisher.</li>
			<li>Mantenga los picos significativamente enriquecidos que se extienden por al menos dos ventanas consecutivas y deseche picos que cubran solo una ventana.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique las regiones anotadas del genoma (transcripciones) con picos significativamente enriquecidos encontrados por ambos métodos.</li>
	<li>Alternativamente o de forma complementaria, pruebe objetivos específicos de ARN para su enriquecimiento en las muestras ip.<ol>
<li>Transcriba inverso el ARN (mismo volumen de muestras de entrada, IP y simulación) con hexameros aleatorios.</li>
		<li>Realice PCR cuantitativo en tiempo real en los objetivos elegidos, comparando entrada, IP y simulación a través del método ΔΔCt. NOTA: El producto generado no debe ser superior a 100 bp, ya que este es el tamaño medio de fragmentación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El ARN lleva más de cien modificaciones de base distintas4 que forman el epitranscriptome44. Estas modificaciones añaden una capa adicional de regulación de la traducción y la señalización (revisada en5,6,8,20,45,46). Los primeros estudios fueron capaces de detectar la presencia de modificaciones post-transcripcionales en ARN28,47, pero los ARN modificados específicos necesitan ser identificados con el fin de entender el papel de la epitranscriptomica. MeRIP fue diseñado como un método para mapear sitios de metilación de ARN de todo el mundo21,22. Se puede adaptar a cualquier modificación, si hay un anticuerpo específico disponible.
La principal fortaleza de este protocolo es que es relativamente simple, seguro para el ARN y el usuario (por ejemplo, 5-azaC es altamente tóxico para las plantas y los seres humanos) y no requiere información de secuencia o modificación de enzimas. Además, el enriquecimiento de ARN metilados por la P.I. aumenta las posibilidades de que se detecten mRNAs de baja abundancia, a diferencia de la secuenciación de bisulfitos que no contiene un paso de enriquecimiento. Cuando se realizan dos rondas serie de MeRIP, el enriquecimiento en fragmentos de ARN que contienen sitios de metilación aumenta aún más22. Una de las limitaciones de MeRIP, especialmente cuando se aplica a estudios de metilación de ARNm, es la alta cantidad de ARN requerida como entrada para el ensayo. El paso de ribodepleción – o poli(A) – reducirá el fondo causado por el ARN ribosomal fuertemente modificado, pero elimina más del 90% del ARN total. El ADN también debe eliminarse por completo, ya que es rico en citosinas metiladas de 5. Otro inconveniente es la menor resolución de la posición exacta de la metilación. La sonicación del ARN antes de la incubación con el anticuerpo ayuda a esta dirección al reducir la región que contiene la modificación a 100-200 nucleótidos. Cuando MeRIP se combina con secuenciación profunda, la resolución de la predicción del sitio m5C aumenta a medida que la secuenciación lee formar una distribución gaussiana alrededor del sitio potencial de metilación. Además, la especificidad del anticuerpo debe confirmarse antes del ensayo (por ejemplo, con ensayos de manchas de puntos de ARN, realizados con oligos sintetizados con nucleótidos modificados), sin embargo, hasta qué punto un anticuerpo puede distinguir realmente entre modificaciones estrechamente relacionadas (por ejemplo, m6A y m6Am) es un punto de discusión en el campo48,49. Además, los ARN altamente estructurados podrían interferir con la interacción anticuerpo-antígeno, otra restricción que se aborda principalmente con la fragmentación y desnaturalización del ARN antes de la P.I. Por el contrario, la secuenciación de bisulfitos que también se ve afectada por estructuras secundarias, no incluye un paso de fragmentación y esta podría ser una razón que causa discrepancia entre los sitiosm5C y los mRNAs predichos por la secuenciación de bisulfitos16 y MeRIP-seq11,17. Otras modificaciones de la citosina (por ejemplo, hm5C) también son resistentes a la deaminación mediada por bisulfito35.
Las modificaciones de MeRIP-seq incluyen un paso de enlace cruzado, ya sea con la introducción de un ribonucleoside fotoactivatable (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50)o utilizando luz UV para crear enlaces cruzados anticuerpo-ARN después de la IP (miCLIP49,método diferente al miCLIP descrito en la introducción30,pero también con resolución de nucleótidos individuales). En el futuro, y a medida que se acumule conocimiento sobre la metilación del ARN, podrían ser preferibles enfoques más específicos, basados en las enzimas modificadoras y/o en las secuencias de consenso donde aparece la metilación. La identificación de las proteínas lectoras es esencial para la comprensión de la función molecular y de señalización de las modificaciones post-transcripcionales. La tecnología de secuenciación nanopore ya permite la identificación directa de nucleótidos modificados sin tratamiento previo del ARN17, pero todavía hay margen de mejora en este campo con respecto a la profundidad de secuencia y el análisis bioinformática. En general, MeRIP-seq es actualmente un enfoque establecido, confiable e imparcial para identificar transcripciones de ARN metiladas.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

En los tres reinos de la vida, las especies de ARN se someten a modificaciones post-transcripcionales y la investigación sobre estas modificaciones bioquímicas funcionalmente relevantes se llama "epitranscriptomics". La epitranscriptomics es un campo en crecimiento y se están desarrollando varios métodos para estudiar y mapear las modificaciones en moléculas de ARN (revisadas en1,2). Se han encontrado más de un centenar de modificaciones de ARN, detectadas en arneses, tRNAs, otros nRNAs, así como arneses3,4. Aunque la presencia y función de modificaciones post-transcripcionales químicamente diversas en tRNAs y ARN se estudian extensamente5,6,7,8, sólo recientemente se han caracterizado modificaciones del ARNM. En las plantas, se han identificado muchas modificaciones de ARNm hasta la fecha, incluyendo m7G en la estructura de la tapa9,m1A10,hm5C11,12,y uridilación13. Sin embargo, sólo m6A10,14,15,m5C11,16,17,y pseudouridina18 han sido mapeados en todo el transcriptoma en Arabidopsis. Las modificaciones de la base del ARNm post-transcripcional están involucradas en varios procesos de desarrollo19,20.
Uno de los enfoques más utilizados en la epitranscriptomicidad es la inmunoprecipitación de ARN metilada junto con la secuenciación profunda (MeRIP-seq). MeRIP-seq fue desarrollado en 2012 para estudiar m6A en células de mamíferos21,22. Requiere el uso de un anticuerpo para la modificación deseada y tiene como objetivo enriquecer para los fragmentos de ARN que llevan los nucleótidos modificados. Por lo general, es seguido por secuenciación profunda para identificar y mapear los fragmentos enriquecidos o PCR cuantitativo para verificar objetivos específicos de ARN. La precisión de MeRIP se basa en la especificidad del anticuerpo para reconocer el nucleótido modificado sobre modificaciones similares (por ejemplo, m5C y hm5C11,23). Además delm6A, MeRIP-seq también se ha aplicado para estudiar metilación de ARNm1A y m5C en varios organismos11,17,23,24,25.
La metilación de la citosina en la quinta posición de carbono (m5C) es la modificación de ADN más prevalente26,27 y una de las modificaciones de ARN más comunes también3,4. Mientras que m5C fue detectado en mRNAs eucariota en 197528, sólo recientemente tienen estudios centrados en mapear la modificación en todo el transcriptoma, en codificación y no codificación RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Los métodos alternativos utilizados en la investigación de ARN m5C incluyen la conversión química de citosinas no metiladas en uracils (secuenciación de bisulfito) y ensayos de inmunoprecipitación basados en una unión irreversible de una metiltransferasa de citosina de ARN conocida a sus objetivos de ARN (miCLIP, aza-IP). En resumen, la secuenciación de bisulfito explota la característica de la citosina metilada de 5 para ser resistente al tratamiento con bisulfito de sodio que deamina citostinas nomodificadas a uracil. El método fue desarrollado por primera vez para el ADN, pero adaptado para arn también y muchos estudios han elegido este enfoque para detectar sitios m5C en ARN16,23,29,32,34,35. Tanto miCLIP como aza-IP requieren conocimientos previos de la citosina de ARN metiltransferasa y el uso del anticuerpo respectivo. En el caso de miCLIP (metilación individual-nucleótida-resolución de enlace e inmunoprecipitación), la metiltransferasa lleva una sola mutación de aminoácidos para que se una al sustrato de ARN pero no se puede liberar30. En aza-IP (inmunoprecipitación de ARN mediada en 5 azacitadina), la unión irreversible se forma entre el nucleósido de 5 azaC y la arnesina metiltransferasa cuando la 5-azaC proporcionada exógenamente es incorporada por las polimerasas de ARN en una molécula de ARN objetivo31.
La principal ventaja de estos tres métodos es que permiten la asignación de resolución de nucleótidos únicos de m5C. Además, miCLIP y aza-IP proporcionan información sobre los objetivos específicos de una citosina de arnesa metiltransferasa seleccionada, descifrando más profundamente el mecanismo y el papel de las modificaciones post-transcripcionales del ARN. Sin embargo, el enfoque MeRIP-seq puede identificar regionesm5C de todo el transcriptoma sin ningún conocimiento previo requerido y evita condiciones químicas y de temperatura duras, como el tratamiento de bisulfitos o la incubación con 5-azaC. La secuenciación de merip y bisulfito puede ser inhibida por las estructuras secundarias de ARN36. El paso de fragmentación que se incluye en el ensayo MeRIP antes de la inmunoprecipitación tiene como objetivo facilitar la unión de anticuerpos y aumentar la resolución de la identificación m5C.
Otro método que vale la pena mencionar es la espectrometría de masas (EM) de nucleósidos de ARN. La EM puede detectar y distinguir cualquier tipo de modificación tanto en el ADN como en el ARN. Brevemente, el ARN se extrae y DNase digiere, luego se desala y digiere a nucleósidos individuales. Los nucleósidos de ARN son analizados por un espectrómetro de masas. Este método se puede utilizar para cuantificar los niveles de cada modificación y no se basa en un anticuerpo o una conversión química. Sin embargo, un inconveniente importante es que proporciona información masiva sobre la presencia de modificaciones de ARN. Para mapear las modificaciones, la EM debe combinarse con la información de digestión y secuenciación de RNase sobre moléculas específicas de ARN, como en el caso del tRNALeuhumano (CAA)37.
Aquí, describimos y discutimos el ensayo MeRIP tal como se utiliza para estudiar la metilación de ARN m5C en Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

Las modificaciones de base secundarias en el ARN, como m5C, afectan a la estructura y función de las moléculas modificadas de ARN. Inmunoprecipitación y secuenciación de ARN metilado (MeRIP-seq) es un método que tiene como objetivo enriquecer el ARN metilado y, en última instancia, identificar transcripciones modificadas. Brevemente, el ARN sonicado se incuba con un anticuerpo para citosinas metiladas de 5 y se precipita con la ayuda de cuentas G proteicas. A continuación, los fragmentos enriquecidos se secuencian y los sitios potenciales de metilación se asignan en función de la distribución de las lecturas y la detección de picos. MeRIP se puede aplicar a cualquier organismo, ya que no requiere ninguna secuencia previa o modificar el conocimiento enzimático. Además, además de la fragmentación, el ARN no se somete a ningún otro tratamiento químico o de temperatura. Sin embargo, MeRIP-seq no proporciona predicción de nucleótidos únicos del sitio de metilación como otros métodos, aunque el área metilada se puede reducir a unos pocos nucleótidos. El uso de diferentes anticuerpos específicos de modificación permite ajustar MeRIP para las diferentes modificaciones de base presentes en el ARN, ampliando las posibles aplicaciones de este método.

Se proporciona un esquema del método en la figura 1. Los primeros pasos críticos del protocolo son obtener ARN de buena calidad (RIN ≥ 7) y sonicarlo a aproximadamente fragmentos de 100 nt. La eficiencia de ambos pasos es examinada por una máquina de electroforesis capilar a base de virutas. En la Figura 2A, se muestra una ejecución representativa de una buena muestra de ARN. La muestra se diluye 1:10 antes de cargar en el chip con el fin de tener una concentración que está en el rango de detección del kit utilizado (5-500 ng / μL). El mismo ejemplo también se ejecuta después de la sonicación y se muestra en la figura 2B. Observe la presencia de un pico uniforme desplazado a la izquierda del diagrama, a un tamaño de alrededor de 100 nucleótidos. La menor concentración se debe tanto a la pérdida de ARN durante la fragmentación como al aumento del volumen de las muestras (60-100 μL, paso 1.7.1).
La calidad de las muestras IP y Mock se puede evaluar mediante qRT-PCR. Con este fin, los IVT con picos sirven como controles positivos y negativos: se espera que la IVT metilada, donde en todas las posiciones de citosina hay m5C, se enriquezca en gran medida en la muestra ip; por el contrario, la IVT no metilada no debería tener una diferencia entre IP y Mock. Las imprimaciones utilizadas en el ensayo qRT-PCR para los dos IVT de control(EGFP y Renilla luciferase) se enumeran en el cuadro 1. De hecho, como se muestra en la Figura 3, alrededor del 80% del IVT metilado se recuperó en la muestra IP, y sólo aproximadamente el 2% en el Simulado. Para el control no metilado, la recuperación fue inferior al 1% tanto en muestras IP como simuladas. Esto verifica la eficiencia de MeRIP que los fragmentos de ARN metilados fueron precipitados y enriquecidos, y es un buen indicador de que las muestras se pueden utilizar para el análisis posterior. Además, el enriquecimiento plegable de la IVT no metilada (relación IP-Simulado) puede aplicarse como umbral para estimar la importancia del enriquecimiento en los ensayos qRT-PCR.
Después de alinear las lecturas con el genoma (Figura 4), los algoritmos de llamada máxima descritos en los pasos 3.4.1 y 3.4.2 se aplican para identificar las ventanas estadísticamente significativas, enriquecidas en las muestras IP en comparación con la entrada. Las secuencias que corresponden a estas ventanas se pueden utilizar más, por ejemplo, para buscar motivos relacionados con la metilación conservados11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo MeRIP-seq. Las muestras de ARN se incuban con un anticuerpo para citosinas metiladas con 5 y los complejos se extraen con cuentas magnéticas G proteicas que capturan los anticuerpos junto con el ARN unido. Las muestras de ARN eluted son analizadas por secuenciación profunda y qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos del análisis de calidad de muestras de ARN. (A) Perfil representativo de una muestra total cualificada de la planta de ARN. (B) Perfil representativo de una muestra de ARN después de la sonicación a fragmentos de 100 nt. Archivos de salida del software de electroforesis capilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Figura 3: análisis qRT-PCR de los IVT de control. Las transcripciones in vitro metiladas y no metiladas se utilizaron como controles positivos y negativos del ensayo MeRIP, respectivamente. Después de la inmunoprecipitación, el IVT metilado está altamente enriquecido en la muestra IP (verde) pero no en la muestra Simulada (sin anticuerpo anti-m5C; púrpura). El IVT no metilado no mostró ningún enriquecimiento ni diferencia entre IP y Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Figura 4: Lea la alineación antes y después de MeRIP alrededor de una transcripción representativa. Lee alineado con una transcripción específica en el ejemplo entrada (fila superior) y en dos réplicas IP (fila central e inferior). La caja negra muestra una ventana enriquecida identificada de 50 nt de largo basada en macs243 y meRIP-seq22 análisis de alta llamada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Objetivo</td>
			<td colspan="2">Primer par</td>
			<td colspan="2">Secuencia de productos</td>
			<td>Longitud del producto</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla luciferasa</td>
			<td colspan="2">Para: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Información sobre las imprimaciones y los productos generados para el análisis qRT-PCR.
Recetas de búfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m5C en Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

Video: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Investigación

Bioquímica

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genética

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Biología del Desarrollo

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterización de modificaciones de ARN en neuronas individuales mediante espectrometría de masas

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Química

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biología

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Explorando los epitrancrismos de m6A y m5C sobre la infección viral: un ejemplo con el VIH

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m⁵C en Arabidopsis

Resumen

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Un método para medir el ARN