Name: methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis at JoVE.com

Bu çalışma, E.S.'ye imprs doktora ödeneği, V.P.'ye EMBO Uzun Vadeli Burs ve F.K.'ye MPI-MPP iç fonları ile desteklenmiştir. Yazarlar, makale hakkındaki biyoinformatik analiz ve yorumlar için Federico Apelt'e ve biyoinformatik analiz için Mathieu Bahin ve Amira Kramdi'ye teşekkür eder.

1. RNA'nın Hazırlanması
<ol><li>200 mg bitki dokusunu sıvı nitrojende toz haline getirin, dokunun işlem boyunca donmuş kalmasını sağlamak.</li>
	<li>Bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünden sonra RNA'yı istenen bitki dokusundan çıkarın. Faz ayrımı sırasında RNA'yı DNA ile kirletme olasılığını azaltmak için kloroform yerine 1-bromo-3-kloropropane kullanın.<ol>
<li>Öğütülen bitki dokusuna guanidin tiyosiyanat ve asit fenol içeren 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin (100 mg doku başına 500 μL). Ters çevirerek iyice karıştırın ve tüm dokunun ıslak olduğundan emin olun. Ribonucleoprotein komplekslerini ayrıştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>200 μL 1-bromo-3-kloropropane (500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 100 μL) ve girdabı kuvvetlice ekleyin.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 15 dakika santrifüj ve üst sulu fazı (yaklaşık 500 μL) yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>1 hacimli izopropanol (500 μL) ve 0,1 hacim 3 M sodyum asetat pH 5,5 (50 μL) ekleyin, -20 °C'de 10 dakika ters çevirip çökelterek iyice karıştırın. NOT: RNA yağışını arttırmak için sodyum asetat (NaOAc) kullanılması önerilir. Protokol bu noktada RNA'nın yağışını birkaç saat hatta bir gecede uzatarak duraklatılabilir.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
		<li>Peletı 500 μL% 80 EtOH ile iki kez yıkayın, 4 ° C'de 12.000 x g'da 5 dakika santrifüj ve atın.</li>
		<li>Peletı bir kez 500 μL% 99 EtOH ile yıkayın, 4 ° C'de 12.000 x g'da 5 dakika santrifüj ve atın.</li>
		<li>Peleti 5-10 dakika kurutun ve 30 μL RNase içermeyen H2O'da çözün. NOT: Bunun yerine, seçtiğiniz herhangi bir RNA ayıklama protokolünü (örneğin, sütun tabanlı bir sistem) kullanın. Bir DNase sindirimi protokole dahil edilirse, aşağıdaki adımda atlayın (adım 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>RNA konsantrasyonunu ölçün (örneğin, spektrofotometre kullanarak) ve 20 μg RNA'yı DNase ile sindirin. NOT: DNA m5C bakımından zengindir ve antikor DNA ve RNA arasında ayrım yapmaz.<ol>
<li>Tipik bir DNase reaksiyonunda, 50 μL reaksiyonda 10 μg RNA'yı tedavi edin. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın ve reaksiyonları 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın: 10 μg RNA x μL 10x DNase tampon 5 μL Dinaz 1 μL (2 birim) RNase içermeyen H2O 50 μL'ye kadar</li>
		<li>Enzimi, uygun miktarda DNase inaktivasyon reaktifi ekleyerek (DNaz kitine dahilse ve üreticinin talimatlarına göre) veya bir temizleme adımı (örneğin, kolon saflaştırma veya fenol/ kloroform ekstraksiyonu) gerçekleştirerek çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kılcal elektroforez ile izole RNA'nın kalitesini ve saflığını kontrol edin ve numunelerin kaliteli olduğundan emin olmak için RNA bütünlük numarası (RIN) 7'den yüksekse devam edin.</li>
	<li>İsteğE BAĞLI: Bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ve üreticinin protokolüne göre mRNA içeriğindeki örnekleri zenginleştirmek için ribozomal RNA'yı çıkarın.<ol>
<li>RRNA tükenme reaksiyonları için önceki adımdan DNase ile tedavi edilen RNA'yı kullanın. Toplam RNA miktarı reaksiyon için önerilen maksimum miktardan fazlaysa birden fazla reaksiyon gerçekleştirin.</li>
		<li>RRNA tükendikten sonra giriş miktarının sadece %5-10'unun kurtarılacağını unutmayın. rRNA tükenmiş RNA'ya (tüm örnekler için eşit tutar) devam edin ve toplam RNA'ya atıfta bulunduğundan, aşağıdaki adımlarda belirtilen tutarları yoksayın. NOT: Kullanılabilir rRNA tükenme yöntemlerinin karşılaştırılması ve açıklaması için bkz. rRNA, toplam RNA'nın önemli bir parçasıdır ve birçok organizmada m5C metillenmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrol RNA dizileri olarak kullanılmak üzere önceden in vitro transkriptleri (IVT) hazırlayın ve örneklere ekleyin.<ol>
<li>MeRIP'te sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak hizmet etmek için biri metilasyonsuz nükleozidli ve diğeri rCTP'nin 5-metil-rCTP ile değiştirildiği bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak iki farklı IVT üretin. Hazırlanan transkriptler EGFP ve Renilla luciferase'nin transkriptleriydi. NOT: IVT'ler analiz ettiğiniz organizmanın transkriptomunda bulunmamalıdır. IVT'ler aynı şablondansa (örneğin, her ikisi de EGFP), pozitif ve negatif kontrolü iki farklı örneğe ekleyin. Dizileri farklıysa (örneğin EGFP ve Renilla), aynı örneğe eklenebilirler.</li>
		<li>Kontroller olarak her numunede 3 μg RNA başına 0,1 ng IVT artış.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA'yı yaklaşık 100 nt parçaya ayırın. NOT: RNA kesme koşulları önceden ayarlanmalıdır ve her sonicator için farklılık gösterir. Burada kullanılan model için sonication aşağıdaki koşullarla gerçekleştirilir: Tepe gücü 174, Görev faktörü 10, Döngüler / patlama 200, 17 dk.<ol>
<li>RNase içermeyen H 2 O ile doldurulmuş, toplam hacmin 80 μL'sinde (min 60 μL, maksimum 100 μL) numune başına en az12μg RNA olan tüm numuneler için aynı miktarda RNA'yı sonicate edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonikasyonun verimliliğini ve RNA örneklerinin kılcal elektroforez ile konsantrasyonunu onaylayın. Parçalanmış RNA'nın ortalama boyutu 100 nt civarında olmalıdır.</li>
</ol>2. Metillenmiş RNA İmmün Önseçme (MeRIP)
<ol><li>Düşük bağlayıcı tüplerde, konsantrasyona bağlı olarak 60 μL'ye (veya daha fazla) kadar 9 μg sonicated RNA ve RNase içermeyen H2O ekleyin.</li>
	<li>RNA'yı bir su banyosunda 70 °C'de 10 dakika ısıtarak ve bir buzlu su karışımında 10 dakika daha soğutarak ikincil yapıları ayrıştırın.</li>
	<li>Numuneyi üç parçaya bölün: Giriş örneği olarak -80 °C'de ayrı bir tüpe üçte biri (2.1 adımında 60 μL alınmışsa 20 μL) kaydedilir. Kalan 40 μL'yi 860 μL'ye kadar RNase içermeyen H2O ile doldurun ve ardından iki düşük bağlayıcı tüpe bölün: biri IP ve diğeri Mock kontrolü için (her biri 430 μL).</li>
	<li>Her iki tüpe de ekleyin: 50 μL 10x MeRIP tampon 10 μL RNaz inhibitörü Mock örneğinde 10 μL H 2 O başına IP örneğinde 10 μL α-m5C antikor(10μg) NOT: Daha önce kullanılan antikor klonu artık ticari olarak mevcut değildir. Bununla birlikte, herhangi bir anti-5-metilistikozin monoklonal antikor benzer şekilde çalışmalıdır. Antikorlar MeRIP11,23için kullanılmadan önce özgüllük için test edilmelidir.</li>
	<li>Tüpleri parafilm ile kapatın ve tepegöz dönüşü ile 4 °C'de 12-14 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, protein G manyetik boncuklarını bağlama için hazırlayın.<ol>
<li>Her tüp için (IP veya Mock kontrolü), 40 μL boncuk kullanın. Toplam boncuk miktarını ekleyin (# tüp sayısı x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için, 160 μL boncuk gereklidir) 15 mL'lik bir tüpte ve numune başına 800 μL 1x MeRIP tamponu ile üç kez yıkayın (# tüp x 800 μL tampon, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numuneleri için 3,2 mL).</li>
		<li>Havai dönüş ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkamalar gerçekleştirin, boncukları manyetik bir raf yardımıyla toplayın ve yıkama tamponu atın. Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları alınan boncukların ilk hacmiyle aynı hacimde 1x MeRIP tamponunda yeniden ıslatır (# tüp x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için 160 μL 1x MeRIP tampon). NOT: Kullanılan protein G boncuk miktarı, boncukların spesifik antikor tipi için bağlanma kapasitesine ve kullanılan antikor miktarına göre belirlenir. Bu durumda, boncuklar, boncuk mg'ı başına yaklaşık 8 μg fare IgG ve 30 mg / mL konsantrasyonu bağlama kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, yaklaşık 9,6 μg antikor bağlamak için 40 μL yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her IP ve Mock örneğine 40 μL resüspended boncuk ekleyin ve tepegöz dönüşü ile 4 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant atın veya kontrol olarak kaydedin (bağlı olmayan RNA örneği).</li>
	<li>%0,01 Ara 20 ile birlikte verilen 700 μL'lik 1x MeRIP tamponunda yeniden canlanarak ve havai dönüş ile oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırarak boncukları 5 kez yıkayın.</li>
	<li>Yıkanmış boncukları 200 μL Proteinaz K sindirim tamponunda yeniden ıslatın ve 50 °C'de 3 saat boyunca 800 rpm'de sallanarak 3,5 μL Proteinase K. Incubate ekleyin. Bazen, kuluçka sırasında bir boncuk tortusu oluşuyorsa, tüpün altına manuel olarak vurun.</li>
	<li>RNA'yı 800 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ek olarak ve bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünü izleyerek çıkarın ve adım 1.2'deki gibi devam edin. RNA peletinin görünürlüğünü artırmak için, yağış adımında izopropanol içine renkli bir yardımcı çökelti eklenebilir. Peleti 20 μL RNase içermeyen H2O'da (veya adım 2.3'te tutulan Giriş hacmine eşit) yeniden sakla.</li>
</ol>3. Aşağı akış analizi
<ol><li>50 temel okuma uzunluğuna (SE50) sahip tek uçlu sıralama için Giriş ve IP örneklerini gönderin.</li>
	<li>Cutadapt41 kullanarak 3' uç adaptörleri kırpın ve 48 nt'den kısa okumaları atın.</li>
	<li>Harita kesilmiş, uyumsuzlar için% 6'lık bir kesme ve maksimum 10 kb intron boyutu ile STAR42 kullanarak Arabidopsis genomuna (TAIR10 ek açıklama) okur. Daha fazla analiz için benzersiz haritalı okumalar tutun.</li>
	<li>İki farklı yöntem kullanarak Giriş'e kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş RNA parçalarını tanımlayın ve her ikisi tarafından önemli ölçüde zenginleştirilmiş olanları göz önünde bulundurun.<ol>
<li>İlk olarak, havuza alındı IP'lerde MacS2 tepe arayan43'ü kullanarak MeRIP-seq tepelerini algılayın.</li>
		<li>İkinci olarak, Meyer ve ark.22 ve Yang ve ark.17'deaçıklandığı gibi MeRIP-seq tepe çağrısı analizini izleyin.<ol>
<li>Özel R komut dosyaları kullanarak, genomunu farklı 25 nt pencerelere bölün ve son eşlenen nükleotitin konumuna göre her pencere için benzersiz olarak eşlenen okuma sayısını sayın (okumalar 100 nt RNA parçalarından kaynaklandığından).</li>
			<li>IP örneklerinde, Fisher Exact Testi ile Giriş ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde zenginleştirilmiş pencereleri hesaplayın.</li>
			<li>En az iki ardışık pencereye yayılan önemli ölçüde zenginleştirilmiş tepeleri koruyun ve yalnızca bir pencereyi kaplayan tepeleri atın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genomun açıklamalı bölgelerini (transkriptler) her iki yöntem tarafından bulunan önemli ölçüde zenginleştirilmiş zirvelerle tanımlayın.</li>
	<li>Alternatif veya tamamlayıcı olarak, belirli RNA hedeflerini IP örneklerinde zenginleştirmeleri için test edin.<ol>
<li>RNA'yı (aynı giriş hacmi, IP ve Mock örnekleri) rastgele altıgenlerle ters yazıya dök.</li>
		<li>ΔΔCt yöntemiyle Giriş, IP ve Mock'u karşılaştırarak seçilen hedeflerde nicel gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. NOT: Ortalama parçalanma boyutu olduğundan, oluşturulan ürün 100 bp'den uzun olmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.

RNA, epitranscriptome44'ü oluşturan yüzden fazla farklı temel değişiklik4taşır. Bu değişiklikler, çeviri ve sinyalizasyonun ek bir düzenleme katmanını ekler(5,6,8,20,45,46'da incelenmiştir). İlk çalışmalar RNA28,47'de transkripsiyon sonrası değişikliklerin varlığını tespitedebildi,ancak epitranscriptomiklerin rolünü anlamak için belirli modifiye RNA'ların tanımlanması gerekiyor. MeRIP, RNA metilasyon sitelerini haritalamak için bir yöntem olarak tasarlanmıştır transcriptome-wide21,22. Belirli bir antikor varsa, herhangi bir değişikliğe uyarlanabilir.
Bu protokolün ana gücü, RNA ve kullanıcı için nispeten basit, güvenli olmasıdır (örneğin, 5-azaC bitkiler ve insanlar için oldukça zehirlidir) ve dizi veya enzim bilgilerini değiştirme gerektirmez. Ayrıca, metillenmiş RNA'ların IP tarafından zenginleştirilmesi, zenginleştirme adımı içermeyen bisülfit diziliminin aksine, düşük bol miktarda mRNA'nın algılanma şansını artırır. İki seri MeRIP turu gerçekleştirildiğinde, metilasyon alanlarını içeren RNA parçalarında zenginleştirme daha da artar22. Özellikle mRNA metilasyon çalışmalarına uygulandığında MeRIP'in sınırlamalarından biri, test için giriş olarak gereken yüksek miktarda RNA'dır. Ribodepletion – veya poly(A) zenginleştirme – adımı ağır modifiye ribozomal RNA'nın neden olduğu arka planı azaltacaktır, ancak toplam RNA'nın% 90'ından fazlasını giderir. DNA, 5 metillenmiş sitozin bakımından zengin olduğu için tamamen çıkarılmalıdır. Diğer bir dezavantaj, metilasyonun tam konumunun daha düşük çözünürlüğüdür. Antikor ile inkübasyondan önce RNA'nın sonication 100-200 nükleotidler için modifikasyon içeren bölgeyi daraltarak bu yönde yardımcı olur. MeRIP derin sıralama ile birleştirildiğinde, sıralama okumaları potansiyel metilasyon alanı etrafında gauss dağılımı oluşturdukça m5C site tahmininin çözünürlüğü artar. Ek olarak, antikorun özgüllüğünün testlerden önce doğrulanması gerekir (örneğin, modifiye nükleotitlerle sentezlenen oligos ile gerçekleştirilen RNA nokta lekeli testlerle), ancak bir antikorun aslında yakından ilişkili modifikasyonları (örneğin, m6A ve m6Am) ne ölçüde ayırt edebileceği48,49alanında bir tartışma noktasıdır. Ayrıca, yüksek yapılandırılmış RNA'lar antikor-antijen etkileşimini engelleyebilir, bu da çoğunlukla IP'den önce RNA'nın parçalanması ve denatürasyonu ile giderilen başka bir kısıtlamadır. Aksine, ikincil yapılardan da etkilenen bisulfite dizilimi bir parçalanma adımı içermez ve bu, bisulfite dizilimi16ve MeRIP-seq11 ,17tarafından tahmin edilen m5 C siteleri ile mRNA'lar arasında tutarsızlığa neden olan bir neden olabilir. Diğer sitozin modifikasyonları (örneğin, hm5C) bisülfit aracılı deaminasyona karşı da dirençlidir35.
MeRIP-seq'in modifikasyonları bir çapraz bağlama adımı içerir, ya fotoaktiviva edilebilir ribonucleoside (foto-çapraz bağlama destekli m6A-seq, PA-m6A-seq 50)veya IP'den sonra antikor-RNA çapraz bağlantıları oluşturmak için UV ışığı kullanarak (miCLIP49, giriş30'daaçıklanan miCLIP'ten farklı yöntem , aynı zamanda bireysel nükleotid çözünürlüğü ile). Gelecekte ve RNA metilasyonu hakkındaki bilgi biriktiğinden, modifiye enzimlere ve/ veya metilasyonun göründüğü konsensüs dizilerine dayanarak daha hedefli yaklaşımlar tercih edilebilir. Okuyucu proteinlerin tanımlanması, transkripsiyon sonrası değişikliklerin moleküler ve sinyal işlevinin anlaşılması için gereklidir. Nanopore dizileme teknolojisi, RNA17'nin önceden tedavisi olmadan modifiye nükleotidlerin doğrudan tanımlanmasına izin verir, ancak bu alanda dizi derinliği ve biyoinformatik analiz konusunda hala iyileştirme için yer vardır. Genel olarak, MeRIP-seq şu anda metillenmiş RNA transkriptlerini tanımlamak için yerleşik, güvenilir ve tarafsız bir yaklaşımdır.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Yaşamın her üç krallığında da, RNA türleri transkripsiyon sonrası değişikliklere uğrar ve işlevsel olarak ilgili bu biyokimyasal değişiklikler üzerindeki araştırmalara "epitranscriptomics" denir. Epitranscriptomics büyüyen bir alandır ve RNA molekülleri üzerindeki değişiklikleri incelemek ve haritalamak için çeşitli yöntemler geliştirilmektedir(1,2'degözden geçirilmiştir). RRNA'larda, tRNA'larda, diğer ncRNA'larda ve mRNA'larda3,4'tetespit edilen yüzden fazla RNA değişikliği bulunmuştur. TRNA'larda ve rRNA'larda kimyasal olarak çeşitli transkripsiyon sonrası modifikasyonların varlığı ve işlevi kapsamlı bir şekilde çalışılsa da5,6,7,8, sadece son zamanlarda mRNA modifikasyonları karakterize edilmiştir. Bitkilerde, 9 , m 1 A 10 , hm 5 C 11,12ve uridylation13kapakyapısında m7G dahil olmak üzere bugüne kadar birçok mRNA modifikasyonu tanımlanmıştır. Bununla birlikte, Arabidopsis'te sadecem6A10,14 ,15,m5C 11,16,17 ve psödouridine18 transcriptome-wide haritalanmıştır. Transkripsiyon sonrası mRNA baz modifikasyonları çeşitli gelişimsel süreçlerde yer almaktadır19,20.
Epitranscriptomics'te en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, metillenmiş RNA immünorektasyonu ve derin dizilemedir (MeRIP-seq). MeRIP-seq 2012 yılında memeli hücrelerinde m6A çalışması için geliştirilmiştir21,22. İstenilen modifikasyon için bir antikor kullanılmasını gerektirir ve modifiye nükleotidleri taşıyan RNA parçaları için zenginleştirmeyi amaçlamaktadır. Genellikle zenginleştirilmiş parçaları veya belirli RNA hedeflerini doğrulamak için nicel PCR'yi tanımlamak ve eşlemek için derin sıralama takip edilir. MeRIP'in doğruluğu, benzer değişiklikler (örneğin, m 5 C vehm5 C11,23)üzerinde modifiye nükleotidleri tanımak için antikorun özgüllüğüne dayanır. m6A'nın yanı sıra, MeRIP-seq ayrıca çeşitli organizmalardam 1 Ave m5C RNA metilasyon çalışması için uygulanmıştır11,17,23,24,25.
Sitozinin beşinci karbon pozisyonunda (m5C) metilasyonu en yaygın DNA modifikasyonu26,27 ve en yaygın RNA modifikasyonlarından biridir3,4. 1975 28yılındaökaryotik mRNA'larda m5C tespit edilirken, sadece son zamanlarda modifikasyon transkriptome çapında, kodlama ve kodlama dışı RNA'larda 11,16 ,17, 23,29,30,31,32,33,34haritalamaya odaklanan çalışmalar vardır.
m5C RNA araştırmalarında kullanılan alternatif yöntemler arasında metil olmayan sitozinlerin kimyasal olarak urasillere dönüştürülmesi (bisülfit dizilimi) ve bilinen bir RNA sitozin metiltransfezinin RNA hedeflerine (miCLIP, aza-IP) geri dönüşü olmayan bir bağlanmasına dayanan immün özürlülük tahlilleri sayılabilir. Kısacası, bisülfit dizilimi, 5 metillenmiş sitozinin, değiştirilmemiş sitozinleri urasil'e deaminasyon eden sodyum bisülfit tedavisine dirençli olma özelliğinden yararlanır. Yöntem ilk olarak DNA için geliştirilmiştir, ancak RNA için de uyarlanmıştır ve birçok çalışma RNA16, 23 , 29 , 32,34,35'tem5C bölgelerini tespit etmek için bu yaklaşımı seçmiştir. Hem miCLIP hem de aza-IP, RNA sitozin metiltransfeaz hakkında daha önce bilgi sahibi olmak ve ilgili antikorun kullanımını gerektirir. MiCLIP (metilasyon birey-nükleotid çözünürlüklü çapraz bağlama ve immün önkupitasyon) durumunda, metiltransfeaz tek bir amino asit mutasyonu taşır, böylece RNA substrata bağlanır, ancak serbest bırakılamaz30. Aza-IP'de (5-azacytidine aracılı RNA immün önkupitasyon), 5-azaC nükleozid ve RNA sitozin metiltransferaz arasında geri dönüşü olmayan bağlama oluşur eksojen olarak sağlandığında 5-azaC RNA polimerazları tarafından hedef RNA molekülü31'edahil edilir.
Bu üç yöntemin temel avantajı, m5C'nin tek nükleotid çözünürlük haritalamasına izin vermeleridir. Ek olarak, miCLIP ve aza-IP, transkripsiyonel RNA modifikasyonlarının mekanizmasını ve rolünü daha derinden deşifre ederek, seçilen bir RNA sitozin metiltransfenazının belirli hedefleri hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, MeRIP-seq yaklaşımı, daha önce gerekli herhangi bir bilgi olmadan transkriptom çapındaki m5C bölgelerini tanımlayabilir ve bisülfit tedavisi veya 5-azaC ile inkübasyon gibi zorlu kimyasal ve sıcaklık koşullarından kaçınır. Hem MeRIP hem de bisülfit dizilimi ikincil RNA yapıları tarafından inhibe edilebilir36. İmmün prempripitasyondan önce MeRIP testinde yer alan parçalanma adımı antikor bağlanmasını kolaylaştırmayı ve m5C tanımlama çözünürlüğünü artırmayı amaçlamaktadır.
Bahsetmeye değer bir diğer yöntem de RNA nükleozidlerinin kütle spektrometresi (MS). MS, hem DNA'da hem de RNA'da her türlü modifikasyonu tespit edebilir ve ayırt edebilir. Kısaca, RNA çıkarılır ve DNaz sindirilir, daha sonra tuzdan arındırılır ve tek nükleozidlere sindirilir. RNA nükleozidleri kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu yöntem, her modifikasyonun seviyelerini ölçmek için kullanılabilir ve bir antikora veya kimyasal dönüşüme dayanmaz. Ancak, önemli bir dezavantajı, RNA değişikliklerinin varlığı hakkında toplu bilgi sağlamasıdır. Modifikasyonları haritalamak için MS'in, insan tRNALeu(CAA)37örneğinde olduğu gibi, belirli RNA molekülleri hakkında RNaz sindirimi ve dizileme bilgileri ile birleştirilmesi gerekir.
Burada, Arabidopsis17'dem5C RNA metilasyonını incelemek için kullanılan MeRIP testini tanımlıyor ve tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>anti-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C antibody</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (discontinued), A3002 available</td><td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td></tr><tr><td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free kit</td></tr><tr><td>Co-precipitant of nucleic acids</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Glycoblue, 15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; transcription kit</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td></tr><tr><td>Low-binding reaction tubes</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td></tr><tr><td>Sonication tubes</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA extraction reagent</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary electrophoresis machine</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>discontinued</td><td>5417R model</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 Incubation bath</td></tr></tbody></table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

M5C gibi RNA'daki ikincil baz modifikasyonları, modifiye edilmiş RNA moleküllerinin yapısını ve işlevini etkiler. Metillenmiş RNA İmmün önsepeksiyon ve dizileme (MeRIP-seq), metillenmiş RNA için zenginleştirmeyi ve sonuçta değiştirilmiş transkriptleri tanımlamayı amaçlayan bir yöntemdir. Kısaca, sonicated RNA 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve protein G boncuklarının yardımıyla çökeltilir. Zenginleştirilmiş parçalar daha sonra sıralanır ve okumaların dağılımına ve tepe algılamasına göre potansiyel metilasyon siteleri eşlenir. MeRIP, herhangi bir organizmaya uygulanabilir, çünkü önceden herhangi bir dizi veya enzim bilgisini değiştirme gerektirmez. Ek olarak, parçalanmanın yanı sıra, RNA başka bir kimyasal veya sıcaklık tedavisine tabi değildir. Bununla birlikte, MeRIP-seq, metilasyon bölgesinin diğer yöntemlerde olduğu gibi tek nükleotid tahminini sağlamaz, ancak metillenmiş alan birkaç nükleotide kadar daraltılabilir. Farklı modifikasyona özgü antikorların kullanılması, MeRIP'in RNA'da bulunan farklı baz modifikasyonları için ayarlanmasını sağlar ve bu yöntemin olası uygulamalarını genişletir.

Yöntemin şeması Şekil 1 'de verilmiştir. Protokolün ilk kritik adımları, kaliteli RNA (RIN ≥ 7) elde etmek ve yaklaşık 100 nt parçaya sonalatmaktır. Her iki adımın verimliliği çip bazlı kılcal elektroforez makinesi tarafından incelenir. Şekil 2A'da,iyi bir RNA örneğinin temsili bir çalışması gösterilmiştir. Numune, kullanılan kiti algılama aralığında (5-500 ng/μL) bir konsantrasyona sahip olmak için çipe yüklenmeden önce 1:10'da seyreltilir. Aynı örnek sonikasyondan sonra da çalıştırılır ve Şekil 2B'de gösterilir. Yaklaşık 100 nükleotid büyüklüğünde diyagramın soluna kaydırılmış tek tip bir tepenin varlığına dikkat edin. Düşük konsantrasyon, hem parçalanma sırasında RNA kaybından hem de numunelerin hacminin artmasından kaynaklanır (60-100 μL, adım 1.7.1).
IP ve Mock örneklerinin kalitesi qRT-PCR ile değerlendirilebilir. Bu amaçla, çivili IVT'ler pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eder: tüm sitozin pozisyonlarında m5C bulunan metillenmiş IVT'nin IP örneğinde yüksek oranda zenginleştirilmesi beklenir; aksine, metillenmemiş IVT'nin IP ve Mock arasında bir fark olmamalıdır. İki kontrol IVT'si(EGFP ve Renilla luciferaz) için qRT-PCR testinde kullanılan astarlar Tablo 1'de listelenmiştir. Gerçekten de, Şekil 3'tegösterildiği gibi, metillenmiş IVT'nin yaklaşık% 80'i IP örneğinde ve sadece% 2'si Mock'ta ele geçirildi. Metillenmemiş kontrol için, kurtarma hem IP hem de Mock örneklerinde% 1'in altındaydı. Bu, metillenmiş RNA parçalarının çöke atıldığını ve zenginleştiğini MeRIP'in verimliliğini doğrular ve numunelerin aşağı akış analizi için kullanılabileceğinin iyi bir göstergesidir. Buna ek olarak, metillenmemiş IVT'nin kat zenginleştirmesi (IP'den Mock'a oran) qRT-PCR testlerinde zenginleştirmenin önemini tahmin etmek için bir eşik olarak uygulanabilir.
Okumaları genoma hizaladıktan sonra (Şekil 4), 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarında açıklanan tepe çağırma algoritmaları, GIRIŞe kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş istatistiksel olarak anlamlı pencereleri tanımlamak için uygulanır. Bu pencerelere karşılık gelen diziler, örneğin metilasyonla ilgili motifleri aramak için daha fazla kullanılabilir11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Şekil 1: MeRIP-seq protokolünün şematik gösterimi. RNA örnekleri 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve kompleksler bağlı RNA ile birlikte antikorları yakalayan protein G manyetik boncuklarla aşağı çekilir. Eluted RNA örnekleri derin sıralama ve qRT-PCR ile analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Şekil 2: RNA örneklerinin kalite analizinden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Nitelikli toplam RNA bitki örneğinin temsili profili. (B) Sonication sonra bir RNA örneğinin temsili profili 100 nt parçalara. Kılcal elektroforez yazılımından çıktı dosyaları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Şekil 3: kontrol IVT'lerinin qRT-PCR analizi. Metillenmiş ve metil olmayan in vitro transkriptler sırasıyla MERIP testinin pozitif ve negatif kontrolleri olarak kullanılmıştır. İmmün prekipitasyondan sonra, metillenmiş IVT IP örneğinde (yeşil) yüksek oranda zenginleştirilir, ancak Mock örneğinde (anti-m5C antikor olmadan; mor). Metillenmemiş IVT, IP ve Mock arasında zenginleştirme ve fark göstermedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Şekil 4: MeRIP öncesi ve sonrası hizalamayı temsili bir transkript etrafında okuyun. Giriş örneğinde (üst satır) ve iki IP çoğaltmasında (orta ve alt satır) belirli bir döküme hizalanmış okur. Kara kutu, MACS243 ve MeRIP-seq22 tepe arama analizlerine dayanan tanımlanmış zenginleştirilmiş 50 nt uzunluğunda bir pencere gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td colspan="2">Astar çifti</td>
			<td colspan="2">Ürün sırası</td>
			<td>Ürün uzunluğu</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">İçin: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Devir: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla lucifeze</td>
			<td colspan="2">İçin: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: qRT-PCR analizi için astarlar ve oluşturulan ürünler hakkında bilgi.
Tampon Tarifleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis at JoVE.com

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.5K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Video: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Biyokimya

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genetik

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Gelişim Biyolojisi

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Kimya

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biyoloji

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Viral Enfeksiyon Üzerine m6A ve m5C Epitranscriptomes'i Keşfetmek: HIV ile Bir Örnek

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Arabidopsis'te m⁵C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

RNA ölçülmesi için bir yöntem