Bu çalışma, E.S.'ye imprs doktora ödeneği, V.P.'ye EMBO Uzun Vadeli Burs ve F.K.'ye MPI-MPP iç fonları ile desteklenmiştir. Yazarlar, makale hakkındaki biyoinformatik analiz ve yorumlar için Federico Apelt'e ve biyoinformatik analiz için Mathieu Bahin ve Amira Kramdi'ye teşekkür eder.

1. RNA'nın Hazırlanması
<ol><li>200 mg bitki dokusunu sıvı nitrojende toz haline getirin, dokunun işlem boyunca donmuş kalmasını sağlamak.</li>
	<li>Bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünden sonra RNA'yı istenen bitki dokusundan çıkarın. Faz ayrımı sırasında RNA'yı DNA ile kirletme olasılığını azaltmak için kloroform yerine 1-bromo-3-kloropropane kullanın.<ol>
<li>Öğütülen bitki dokusuna guanidin tiyosiyanat ve asit fenol içeren 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin (100 mg doku başına 500 μL). Ters çevirerek iyice karıştırın ve tüm dokunun ıslak olduğundan emin olun. Ribonucleoprotein komplekslerini ayrıştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>200 μL 1-bromo-3-kloropropane (500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 100 μL) ve girdabı kuvvetlice ekleyin.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 15 dakika santrifüj ve üst sulu fazı (yaklaşık 500 μL) yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>1 hacimli izopropanol (500 μL) ve 0,1 hacim 3 M sodyum asetat pH 5,5 (50 μL) ekleyin, -20 °C'de 10 dakika ters çevirip çökelterek iyice karıştırın. NOT: RNA yağışını arttırmak için sodyum asetat (NaOAc) kullanılması önerilir. Protokol bu noktada RNA'nın yağışını birkaç saat hatta bir gecede uzatarak duraklatılabilir.</li>
		<li>4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
		<li>Peletı 500 μL% 80 EtOH ile iki kez yıkayın, 4 ° C'de 12.000 x g'da 5 dakika santrifüj ve atın.</li>
		<li>Peletı bir kez 500 μL% 99 EtOH ile yıkayın, 4 ° C'de 12.000 x g'da 5 dakika santrifüj ve atın.</li>
		<li>Peleti 5-10 dakika kurutun ve 30 μL RNase içermeyen H2O'da çözün. NOT: Bunun yerine, seçtiğiniz herhangi bir RNA ayıklama protokolünü (örneğin, sütun tabanlı bir sistem) kullanın. Bir DNase sindirimi protokole dahil edilirse, aşağıdaki adımda atlayın (adım 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>RNA konsantrasyonunu ölçün (örneğin, spektrofotometre kullanarak) ve 20 μg RNA'yı DNase ile sindirin. NOT: DNA m5C bakımından zengindir ve antikor DNA ve RNA arasında ayrım yapmaz.<ol>
<li>Tipik bir DNase reaksiyonunda, 50 μL reaksiyonda 10 μg RNA'yı tedavi edin. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın ve reaksiyonları 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın: 10 μg RNA x μL 10x DNase tampon 5 μL Dinaz 1 μL (2 birim) RNase içermeyen H2O 50 μL'ye kadar</li>
		<li>Enzimi, uygun miktarda DNase inaktivasyon reaktifi ekleyerek (DNaz kitine dahilse ve üreticinin talimatlarına göre) veya bir temizleme adımı (örneğin, kolon saflaştırma veya fenol/ kloroform ekstraksiyonu) gerçekleştirerek çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kılcal elektroforez ile izole RNA'nın kalitesini ve saflığını kontrol edin ve numunelerin kaliteli olduğundan emin olmak için RNA bütünlük numarası (RIN) 7'den yüksekse devam edin.</li>
	<li>İsteğE BAĞLI: Bir rRNA kaldırma kiti kullanarak ve üreticinin protokolüne göre mRNA içeriğindeki örnekleri zenginleştirmek için ribozomal RNA'yı çıkarın.<ol>
<li>RRNA tükenme reaksiyonları için önceki adımdan DNase ile tedavi edilen RNA'yı kullanın. Toplam RNA miktarı reaksiyon için önerilen maksimum miktardan fazlaysa birden fazla reaksiyon gerçekleştirin.</li>
		<li>RRNA tükendikten sonra giriş miktarının sadece %5-10'unun kurtarılacağını unutmayın. rRNA tükenmiş RNA'ya (tüm örnekler için eşit tutar) devam edin ve toplam RNA'ya atıfta bulunduğundan, aşağıdaki adımlarda belirtilen tutarları yoksayın. NOT: Kullanılabilir rRNA tükenme yöntemlerinin karşılaştırılması ve açıklaması için bkz. rRNA, toplam RNA'nın önemli bir parçasıdır ve birçok organizmada m5C metillenmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrol RNA dizileri olarak kullanılmak üzere önceden in vitro transkriptleri (IVT) hazırlayın ve örneklere ekleyin.<ol>
<li>MeRIP'te sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak hizmet etmek için biri metilasyonsuz nükleozidli ve diğeri rCTP'nin 5-metil-rCTP ile değiştirildiği bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak iki farklı IVT üretin. Hazırlanan transkriptler EGFP ve Renilla luciferase'nin transkriptleriydi. NOT: IVT'ler analiz ettiğiniz organizmanın transkriptomunda bulunmamalıdır. IVT'ler aynı şablondansa (örneğin, her ikisi de EGFP), pozitif ve negatif kontrolü iki farklı örneğe ekleyin. Dizileri farklıysa (örneğin EGFP ve Renilla), aynı örneğe eklenebilirler.</li>
		<li>Kontroller olarak her numunede 3 μg RNA başına 0,1 ng IVT artış.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA'yı yaklaşık 100 nt parçaya ayırın. NOT: RNA kesme koşulları önceden ayarlanmalıdır ve her sonicator için farklılık gösterir. Burada kullanılan model için sonication aşağıdaki koşullarla gerçekleştirilir: Tepe gücü 174, Görev faktörü 10, Döngüler / patlama 200, 17 dk.<ol>
<li>RNase içermeyen H 2 O ile doldurulmuş, toplam hacmin 80 μL'sinde (min 60 μL, maksimum 100 μL) numune başına en az12μg RNA olan tüm numuneler için aynı miktarda RNA'yı sonicate edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonikasyonun verimliliğini ve RNA örneklerinin kılcal elektroforez ile konsantrasyonunu onaylayın. Parçalanmış RNA'nın ortalama boyutu 100 nt civarında olmalıdır.</li>
</ol>2. Metillenmiş RNA İmmün Önseçme (MeRIP)
<ol><li>Düşük bağlayıcı tüplerde, konsantrasyona bağlı olarak 60 μL'ye (veya daha fazla) kadar 9 μg sonicated RNA ve RNase içermeyen H2O ekleyin.</li>
	<li>RNA'yı bir su banyosunda 70 °C'de 10 dakika ısıtarak ve bir buzlu su karışımında 10 dakika daha soğutarak ikincil yapıları ayrıştırın.</li>
	<li>Numuneyi üç parçaya bölün: Giriş örneği olarak -80 °C'de ayrı bir tüpe üçte biri (2.1 adımında 60 μL alınmışsa 20 μL) kaydedilir. Kalan 40 μL'yi 860 μL'ye kadar RNase içermeyen H2O ile doldurun ve ardından iki düşük bağlayıcı tüpe bölün: biri IP ve diğeri Mock kontrolü için (her biri 430 μL).</li>
	<li>Her iki tüpe de ekleyin: 50 μL 10x MeRIP tampon 10 μL RNaz inhibitörü Mock örneğinde 10 μL H 2 O başına IP örneğinde 10 μL α-m5C antikor(10μg) NOT: Daha önce kullanılan antikor klonu artık ticari olarak mevcut değildir. Bununla birlikte, herhangi bir anti-5-metilistikozin monoklonal antikor benzer şekilde çalışmalıdır. Antikorlar MeRIP11,23için kullanılmadan önce özgüllük için test edilmelidir.</li>
	<li>Tüpleri parafilm ile kapatın ve tepegöz dönüşü ile 4 °C'de 12-14 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, protein G manyetik boncuklarını bağlama için hazırlayın.<ol>
<li>Her tüp için (IP veya Mock kontrolü), 40 μL boncuk kullanın. Toplam boncuk miktarını ekleyin (# tüp sayısı x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için, 160 μL boncuk gereklidir) 15 mL'lik bir tüpte ve numune başına 800 μL 1x MeRIP tamponu ile üç kez yıkayın (# tüp x 800 μL tampon, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numuneleri için 3,2 mL).</li>
		<li>Havai dönüş ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkamalar gerçekleştirin, boncukları manyetik bir raf yardımıyla toplayın ve yıkama tamponu atın. Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları alınan boncukların ilk hacmiyle aynı hacimde 1x MeRIP tamponunda yeniden ıslatır (# tüp x 40 μL, örneğin, 2 IP ve 2 Mock numunesi için 160 μL 1x MeRIP tampon). NOT: Kullanılan protein G boncuk miktarı, boncukların spesifik antikor tipi için bağlanma kapasitesine ve kullanılan antikor miktarına göre belirlenir. Bu durumda, boncuklar, boncuk mg'ı başına yaklaşık 8 μg fare IgG ve 30 mg / mL konsantrasyonu bağlama kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, yaklaşık 9,6 μg antikor bağlamak için 40 μL yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her IP ve Mock örneğine 40 μL resüspended boncuk ekleyin ve tepegöz dönüşü ile 4 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant atın veya kontrol olarak kaydedin (bağlı olmayan RNA örneği).</li>
	<li>%0,01 Ara 20 ile birlikte verilen 700 μL'lik 1x MeRIP tamponunda yeniden canlanarak ve havai dönüş ile oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırarak boncukları 5 kez yıkayın.</li>
	<li>Yıkanmış boncukları 200 μL Proteinaz K sindirim tamponunda yeniden ıslatın ve 50 °C'de 3 saat boyunca 800 rpm'de sallanarak 3,5 μL Proteinase K. Incubate ekleyin. Bazen, kuluçka sırasında bir boncuk tortusu oluşuyorsa, tüpün altına manuel olarak vurun.</li>
	<li>RNA'yı 800 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ek olarak ve bir asit guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon protokolünü izleyerek çıkarın ve adım 1.2'deki gibi devam edin. RNA peletinin görünürlüğünü artırmak için, yağış adımında izopropanol içine renkli bir yardımcı çökelti eklenebilir. Peleti 20 μL RNase içermeyen H2O'da (veya adım 2.3'te tutulan Giriş hacmine eşit) yeniden sakla.</li>
</ol>3. Aşağı akış analizi
<ol><li>50 temel okuma uzunluğuna (SE50) sahip tek uçlu sıralama için Giriş ve IP örneklerini gönderin.</li>
	<li>Cutadapt41 kullanarak 3' uç adaptörleri kırpın ve 48 nt'den kısa okumaları atın.</li>
	<li>Harita kesilmiş, uyumsuzlar için% 6'lık bir kesme ve maksimum 10 kb intron boyutu ile STAR42 kullanarak Arabidopsis genomuna (TAIR10 ek açıklama) okur. Daha fazla analiz için benzersiz haritalı okumalar tutun.</li>
	<li>İki farklı yöntem kullanarak Giriş'e kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş RNA parçalarını tanımlayın ve her ikisi tarafından önemli ölçüde zenginleştirilmiş olanları göz önünde bulundurun.<ol>
<li>İlk olarak, havuza alındı IP'lerde MacS2 tepe arayan43'ü kullanarak MeRIP-seq tepelerini algılayın.</li>
		<li>İkinci olarak, Meyer ve ark.22 ve Yang ve ark.17'deaçıklandığı gibi MeRIP-seq tepe çağrısı analizini izleyin.<ol>
<li>Özel R komut dosyaları kullanarak, genomunu farklı 25 nt pencerelere bölün ve son eşlenen nükleotitin konumuna göre her pencere için benzersiz olarak eşlenen okuma sayısını sayın (okumalar 100 nt RNA parçalarından kaynaklandığından).</li>
			<li>IP örneklerinde, Fisher Exact Testi ile Giriş ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde zenginleştirilmiş pencereleri hesaplayın.</li>
			<li>En az iki ardışık pencereye yayılan önemli ölçüde zenginleştirilmiş tepeleri koruyun ve yalnızca bir pencereyi kaplayan tepeleri atın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genomun açıklamalı bölgelerini (transkriptler) her iki yöntem tarafından bulunan önemli ölçüde zenginleştirilmiş zirvelerle tanımlayın.</li>
	<li>Alternatif veya tamamlayıcı olarak, belirli RNA hedeflerini IP örneklerinde zenginleştirmeleri için test edin.<ol>
<li>RNA'yı (aynı giriş hacmi, IP ve Mock örnekleri) rastgele altıgenlerle ters yazıya dök.</li>
		<li>ΔΔCt yöntemiyle Giriş, IP ve Mock'u karşılaştırarak seçilen hedeflerde nicel gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. NOT: Ortalama parçalanma boyutu olduğundan, oluşturulan ürün 100 bp'den uzun olmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.

RNA, epitranscriptome44'ü oluşturan yüzden fazla farklı temel değişiklik4taşır. Bu değişiklikler, çeviri ve sinyalizasyonun ek bir düzenleme katmanını ekler(5,6,8,20,45,46'da incelenmiştir). İlk çalışmalar RNA28,47'de transkripsiyon sonrası değişikliklerin varlığını tespitedebildi,ancak epitranscriptomiklerin rolünü anlamak için belirli modifiye RNA'ların tanımlanması gerekiyor. MeRIP, RNA metilasyon sitelerini haritalamak için bir yöntem olarak tasarlanmıştır transcriptome-wide21,22. Belirli bir antikor varsa, herhangi bir değişikliğe uyarlanabilir.
Bu protokolün ana gücü, RNA ve kullanıcı için nispeten basit, güvenli olmasıdır (örneğin, 5-azaC bitkiler ve insanlar için oldukça zehirlidir) ve dizi veya enzim bilgilerini değiştirme gerektirmez. Ayrıca, metillenmiş RNA'ların IP tarafından zenginleştirilmesi, zenginleştirme adımı içermeyen bisülfit diziliminin aksine, düşük bol miktarda mRNA'nın algılanma şansını artırır. İki seri MeRIP turu gerçekleştirildiğinde, metilasyon alanlarını içeren RNA parçalarında zenginleştirme daha da artar22. Özellikle mRNA metilasyon çalışmalarına uygulandığında MeRIP'in sınırlamalarından biri, test için giriş olarak gereken yüksek miktarda RNA'dır. Ribodepletion – veya poly(A) zenginleştirme – adımı ağır modifiye ribozomal RNA'nın neden olduğu arka planı azaltacaktır, ancak toplam RNA'nın% 90'ından fazlasını giderir. DNA, 5 metillenmiş sitozin bakımından zengin olduğu için tamamen çıkarılmalıdır. Diğer bir dezavantaj, metilasyonun tam konumunun daha düşük çözünürlüğüdür. Antikor ile inkübasyondan önce RNA'nın sonication 100-200 nükleotidler için modifikasyon içeren bölgeyi daraltarak bu yönde yardımcı olur. MeRIP derin sıralama ile birleştirildiğinde, sıralama okumaları potansiyel metilasyon alanı etrafında gauss dağılımı oluşturdukça m5C site tahmininin çözünürlüğü artar. Ek olarak, antikorun özgüllüğünün testlerden önce doğrulanması gerekir (örneğin, modifiye nükleotitlerle sentezlenen oligos ile gerçekleştirilen RNA nokta lekeli testlerle), ancak bir antikorun aslında yakından ilişkili modifikasyonları (örneğin, m6A ve m6Am) ne ölçüde ayırt edebileceği48,49alanında bir tartışma noktasıdır. Ayrıca, yüksek yapılandırılmış RNA'lar antikor-antijen etkileşimini engelleyebilir, bu da çoğunlukla IP'den önce RNA'nın parçalanması ve denatürasyonu ile giderilen başka bir kısıtlamadır. Aksine, ikincil yapılardan da etkilenen bisulfite dizilimi bir parçalanma adımı içermez ve bu, bisulfite dizilimi16ve MeRIP-seq11 ,17tarafından tahmin edilen m5 C siteleri ile mRNA'lar arasında tutarsızlığa neden olan bir neden olabilir. Diğer sitozin modifikasyonları (örneğin, hm5C) bisülfit aracılı deaminasyona karşı da dirençlidir35.
MeRIP-seq'in modifikasyonları bir çapraz bağlama adımı içerir, ya fotoaktiviva edilebilir ribonucleoside (foto-çapraz bağlama destekli m6A-seq, PA-m6A-seq 50)veya IP'den sonra antikor-RNA çapraz bağlantıları oluşturmak için UV ışığı kullanarak (miCLIP49, giriş30'daaçıklanan miCLIP'ten farklı yöntem , aynı zamanda bireysel nükleotid çözünürlüğü ile). Gelecekte ve RNA metilasyonu hakkındaki bilgi biriktiğinden, modifiye enzimlere ve/ veya metilasyonun göründüğü konsensüs dizilerine dayanarak daha hedefli yaklaşımlar tercih edilebilir. Okuyucu proteinlerin tanımlanması, transkripsiyon sonrası değişikliklerin moleküler ve sinyal işlevinin anlaşılması için gereklidir. Nanopore dizileme teknolojisi, RNA17'nin önceden tedavisi olmadan modifiye nükleotidlerin doğrudan tanımlanmasına izin verir, ancak bu alanda dizi derinliği ve biyoinformatik analiz konusunda hala iyileştirme için yer vardır. Genel olarak, MeRIP-seq şu anda metillenmiş RNA transkriptlerini tanımlamak için yerleşik, güvenilir ve tarafsız bir yaklaşımdır.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Yaşamın her üç krallığında da, RNA türleri transkripsiyon sonrası değişikliklere uğrar ve işlevsel olarak ilgili bu biyokimyasal değişiklikler üzerindeki araştırmalara "epitranscriptomics" denir. Epitranscriptomics büyüyen bir alandır ve RNA molekülleri üzerindeki değişiklikleri incelemek ve haritalamak için çeşitli yöntemler geliştirilmektedir(1,2'degözden geçirilmiştir). RRNA'larda, tRNA'larda, diğer ncRNA'larda ve mRNA'larda3,4'tetespit edilen yüzden fazla RNA değişikliği bulunmuştur. TRNA'larda ve rRNA'larda kimyasal olarak çeşitli transkripsiyon sonrası modifikasyonların varlığı ve işlevi kapsamlı bir şekilde çalışılsa da5,6,7,8, sadece son zamanlarda mRNA modifikasyonları karakterize edilmiştir. Bitkilerde, 9 , m 1 A 10 , hm 5 C 11,12ve uridylation13kapakyapısında m7G dahil olmak üzere bugüne kadar birçok mRNA modifikasyonu tanımlanmıştır. Bununla birlikte, Arabidopsis'te sadecem6A10,14 ,15,m5C 11,16,17 ve psödouridine18 transcriptome-wide haritalanmıştır. Transkripsiyon sonrası mRNA baz modifikasyonları çeşitli gelişimsel süreçlerde yer almaktadır19,20.
Epitranscriptomics'te en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, metillenmiş RNA immünorektasyonu ve derin dizilemedir (MeRIP-seq). MeRIP-seq 2012 yılında memeli hücrelerinde m6A çalışması için geliştirilmiştir21,22. İstenilen modifikasyon için bir antikor kullanılmasını gerektirir ve modifiye nükleotidleri taşıyan RNA parçaları için zenginleştirmeyi amaçlamaktadır. Genellikle zenginleştirilmiş parçaları veya belirli RNA hedeflerini doğrulamak için nicel PCR'yi tanımlamak ve eşlemek için derin sıralama takip edilir. MeRIP'in doğruluğu, benzer değişiklikler (örneğin, m 5 C vehm5 C11,23)üzerinde modifiye nükleotidleri tanımak için antikorun özgüllüğüne dayanır. m6A'nın yanı sıra, MeRIP-seq ayrıca çeşitli organizmalardam 1 Ave m5C RNA metilasyon çalışması için uygulanmıştır11,17,23,24,25.
Sitozinin beşinci karbon pozisyonunda (m5C) metilasyonu en yaygın DNA modifikasyonu26,27 ve en yaygın RNA modifikasyonlarından biridir3,4. 1975 28yılındaökaryotik mRNA'larda m5C tespit edilirken, sadece son zamanlarda modifikasyon transkriptome çapında, kodlama ve kodlama dışı RNA'larda 11,16 ,17, 23,29,30,31,32,33,34haritalamaya odaklanan çalışmalar vardır.
m5C RNA araştırmalarında kullanılan alternatif yöntemler arasında metil olmayan sitozinlerin kimyasal olarak urasillere dönüştürülmesi (bisülfit dizilimi) ve bilinen bir RNA sitozin metiltransfezinin RNA hedeflerine (miCLIP, aza-IP) geri dönüşü olmayan bir bağlanmasına dayanan immün özürlülük tahlilleri sayılabilir. Kısacası, bisülfit dizilimi, 5 metillenmiş sitozinin, değiştirilmemiş sitozinleri urasil'e deaminasyon eden sodyum bisülfit tedavisine dirençli olma özelliğinden yararlanır. Yöntem ilk olarak DNA için geliştirilmiştir, ancak RNA için de uyarlanmıştır ve birçok çalışma RNA16, 23 , 29 , 32,34,35'tem5C bölgelerini tespit etmek için bu yaklaşımı seçmiştir. Hem miCLIP hem de aza-IP, RNA sitozin metiltransfeaz hakkında daha önce bilgi sahibi olmak ve ilgili antikorun kullanımını gerektirir. MiCLIP (metilasyon birey-nükleotid çözünürlüklü çapraz bağlama ve immün önkupitasyon) durumunda, metiltransfeaz tek bir amino asit mutasyonu taşır, böylece RNA substrata bağlanır, ancak serbest bırakılamaz30. Aza-IP'de (5-azacytidine aracılı RNA immün önkupitasyon), 5-azaC nükleozid ve RNA sitozin metiltransferaz arasında geri dönüşü olmayan bağlama oluşur eksojen olarak sağlandığında 5-azaC RNA polimerazları tarafından hedef RNA molekülü31'edahil edilir.
Bu üç yöntemin temel avantajı, m5C'nin tek nükleotid çözünürlük haritalamasına izin vermeleridir. Ek olarak, miCLIP ve aza-IP, transkripsiyonel RNA modifikasyonlarının mekanizmasını ve rolünü daha derinden deşifre ederek, seçilen bir RNA sitozin metiltransfenazının belirli hedefleri hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, MeRIP-seq yaklaşımı, daha önce gerekli herhangi bir bilgi olmadan transkriptom çapındaki m5C bölgelerini tanımlayabilir ve bisülfit tedavisi veya 5-azaC ile inkübasyon gibi zorlu kimyasal ve sıcaklık koşullarından kaçınır. Hem MeRIP hem de bisülfit dizilimi ikincil RNA yapıları tarafından inhibe edilebilir36. İmmün prempripitasyondan önce MeRIP testinde yer alan parçalanma adımı antikor bağlanmasını kolaylaştırmayı ve m5C tanımlama çözünürlüğünü artırmayı amaçlamaktadır.
Bahsetmeye değer bir diğer yöntem de RNA nükleozidlerinin kütle spektrometresi (MS). MS, hem DNA'da hem de RNA'da her türlü modifikasyonu tespit edebilir ve ayırt edebilir. Kısaca, RNA çıkarılır ve DNaz sindirilir, daha sonra tuzdan arındırılır ve tek nükleozidlere sindirilir. RNA nükleozidleri kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu yöntem, her modifikasyonun seviyelerini ölçmek için kullanılabilir ve bir antikora veya kimyasal dönüşüme dayanmaz. Ancak, önemli bir dezavantajı, RNA değişikliklerinin varlığı hakkında toplu bilgi sağlamasıdır. Modifikasyonları haritalamak için MS'in, insan tRNALeu(CAA)37örneğinde olduğu gibi, belirli RNA molekülleri hakkında RNaz sindirimi ve dizileme bilgileri ile birleştirilmesi gerekir.
Burada, Arabidopsis17'dem5C RNA metilasyonını incelemek için kullanılan MeRIP testini tanımlıyor ve tartışıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;&#8208;m5C antibody</td>
			<td>ZymoResearch</td>
			<td>A3001 (discontinued), A3002 available</td>
			<td>Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip and reagents for capillary electrophoresis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>RNA 6000 Nano kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>TURBO DNA-free kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-precipitant of nucleic acids</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Glycoblue, 15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td>T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-binding reaction tubes</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>G017</td>
			<td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>20mg/mL stock solution, RNA grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>RNasin Plus 40 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rRNA removal kit</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>RZPL11016</td>
			<td>Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication tubes</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis machine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>2100 Bioanalyzer System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>5417R model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>R4040</td>
			<td>RotoBot Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td>S220 Focused-ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>NanoDrop OneC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1012</td>
			<td>1012 Incubation bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methylated rna immunoprecipitation assay to study m5c modification in arabidopsis

M5C gibi RNA'daki ikincil baz modifikasyonları, modifiye edilmiş RNA moleküllerinin yapısını ve işlevini etkiler. Metillenmiş RNA İmmün önsepeksiyon ve dizileme (MeRIP-seq), metillenmiş RNA için zenginleştirmeyi ve sonuçta değiştirilmiş transkriptleri tanımlamayı amaçlayan bir yöntemdir. Kısaca, sonicated RNA 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve protein G boncuklarının yardımıyla çökeltilir. Zenginleştirilmiş parçalar daha sonra sıralanır ve okumaların dağılımına ve tepe algılamasına göre potansiyel metilasyon siteleri eşlenir. MeRIP, herhangi bir organizmaya uygulanabilir, çünkü önceden herhangi bir dizi veya enzim bilgisini değiştirme gerektirmez. Ek olarak, parçalanmanın yanı sıra, RNA başka bir kimyasal veya sıcaklık tedavisine tabi değildir. Bununla birlikte, MeRIP-seq, metilasyon bölgesinin diğer yöntemlerde olduğu gibi tek nükleotid tahminini sağlamaz, ancak metillenmiş alan birkaç nükleotide kadar daraltılabilir. Farklı modifikasyona özgü antikorların kullanılması, MeRIP'in RNA'da bulunan farklı baz modifikasyonları için ayarlanmasını sağlar ve bu yöntemin olası uygulamalarını genişletir.

Yöntemin şeması Şekil 1 'de verilmiştir. Protokolün ilk kritik adımları, kaliteli RNA (RIN ≥ 7) elde etmek ve yaklaşık 100 nt parçaya sonalatmaktır. Her iki adımın verimliliği çip bazlı kılcal elektroforez makinesi tarafından incelenir. Şekil 2A'da,iyi bir RNA örneğinin temsili bir çalışması gösterilmiştir. Numune, kullanılan kiti algılama aralığında (5-500 ng/μL) bir konsantrasyona sahip olmak için çipe yüklenmeden önce 1:10'da seyreltilir. Aynı örnek sonikasyondan sonra da çalıştırılır ve Şekil 2B'de gösterilir. Yaklaşık 100 nükleotid büyüklüğünde diyagramın soluna kaydırılmış tek tip bir tepenin varlığına dikkat edin. Düşük konsantrasyon, hem parçalanma sırasında RNA kaybından hem de numunelerin hacminin artmasından kaynaklanır (60-100 μL, adım 1.7.1).
IP ve Mock örneklerinin kalitesi qRT-PCR ile değerlendirilebilir. Bu amaçla, çivili IVT'ler pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eder: tüm sitozin pozisyonlarında m5C bulunan metillenmiş IVT'nin IP örneğinde yüksek oranda zenginleştirilmesi beklenir; aksine, metillenmemiş IVT'nin IP ve Mock arasında bir fark olmamalıdır. İki kontrol IVT'si(EGFP ve Renilla luciferaz) için qRT-PCR testinde kullanılan astarlar Tablo 1'de listelenmiştir. Gerçekten de, Şekil 3'tegösterildiği gibi, metillenmiş IVT'nin yaklaşık% 80'i IP örneğinde ve sadece% 2'si Mock'ta ele geçirildi. Metillenmemiş kontrol için, kurtarma hem IP hem de Mock örneklerinde% 1'in altındaydı. Bu, metillenmiş RNA parçalarının çöke atıldığını ve zenginleştiğini MeRIP'in verimliliğini doğrular ve numunelerin aşağı akış analizi için kullanılabileceğinin iyi bir göstergesidir. Buna ek olarak, metillenmemiş IVT'nin kat zenginleştirmesi (IP'den Mock'a oran) qRT-PCR testlerinde zenginleştirmenin önemini tahmin etmek için bir eşik olarak uygulanabilir.
Okumaları genoma hizaladıktan sonra (Şekil 4), 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarında açıklanan tepe çağırma algoritmaları, GIRIŞe kıyasla IP örneklerinde zenginleştirilmiş istatistiksel olarak anlamlı pencereleri tanımlamak için uygulanır. Bu pencerelere karşılık gelen diziler, örneğin metilasyonla ilgili motifleri aramak için daha fazla kullanılabilir11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> Şekil 1: MeRIP-seq protokolünün şematik gösterimi. RNA örnekleri 5 metillenmiş sitozinler için bir antikor ile inkübe edilir ve kompleksler bağlı RNA ile birlikte antikorları yakalayan protein G manyetik boncuklarla aşağı çekilir. Eluted RNA örnekleri derin sıralama ve qRT-PCR ile analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> Şekil 2: RNA örneklerinin kalite analizinden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Nitelikli toplam RNA bitki örneğinin temsili profili. (B) Sonication sonra bir RNA örneğinin temsili profili 100 nt parçalara. Kılcal elektroforez yazılımından çıktı dosyaları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> Şekil 3: kontrol IVT'lerinin qRT-PCR analizi. Metillenmiş ve metil olmayan in vitro transkriptler sırasıyla MERIP testinin pozitif ve negatif kontrolleri olarak kullanılmıştır. İmmün prekipitasyondan sonra, metillenmiş IVT IP örneğinde (yeşil) yüksek oranda zenginleştirilir, ancak Mock örneğinde (anti-m5C antikor olmadan; mor). Metillenmemiş IVT, IP ve Mock arasında zenginleştirme ve fark göstermedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> Şekil 4: MeRIP öncesi ve sonrası hizalamayı temsili bir transkript etrafında okuyun. Giriş örneğinde (üst satır) ve iki IP çoğaltmasında (orta ve alt satır) belirli bir döküme hizalanmış okur. Kara kutu, MACS243 ve MeRIP-seq22 tepe arama analizlerine dayanan tanımlanmış zenginleştirilmiş 50 nt uzunluğunda bir pencere gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td colspan="2">Astar çifti</td>
			<td colspan="2">Ürün sırası</td>
			<td>Ürün uzunluğu</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">İçin: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Devir: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Renilla lucifeze</td>
			<td colspan="2">İçin: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC ATGTTGCCATCAAAAAATCATGAGAA AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: qRT-PCR analizi için astarlar ve oluşturulan ürünler hakkında bilgi.
Tampon Tarifleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis at JoVE.com

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

6.4K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Video: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...