マリナ・クシェリアヴァ、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャリク、ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの皆様のご支援、そして私たちの議論への貢献に感謝します。得られたデータは、ルスラン・クッツ博士課程の一部です。

以下の手順は、ヘルシンキ宣言及び東京宣言及び欧州共同体の実験動物使用に関するガイドラインに従って行われた。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました.
実験手順のための1.ラットの準備
<ol><li>成人オスのスプレイグ・ドーリーラットを、あから過ぎの病理を伴わず、それぞれ300〜350gの重さを選択する。</li>
	<li>実験前に12時間の明暗サイクルで、室温で全てのラットを22°Cで維持します。</li>
	<li>食べ物と水がアドリビタムで利用できることを確認してください。</li>
	<li>6:00 a. .m~ 2:00 p.m の間ですべての手順を実行します。</li>
</ol>2. 手術用のラットの準備
<ol><li>イオブルラン(誘導で4%、維持のために2%)と24%の酸素(1.5 L /分)でラットを30分間麻酔します。<ol>
<li>彼らはペダル離脱反射を持っていないことを確認することにより、ラットの麻酔のレベルをテストします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24ゲージのカテーテルを尾静脈に挿入します。 注意:血管拡張のための尾の温暖化は行われません。<ol>
<li>テーブルの上にネズミを置いて、上の位置に置きます。医療テープを使用して、ラットの四肢4本すべてを貼り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>温度測定のためのプローブを手術前にラット直腸に入れる。</li>
	<li>手順の間、37°Cのコア体温を支える加熱プレートを維持する。</li>
	<li>保護のためにラットの目の両方に軟膏を追加します。</li>
	<li>手術領域を剃り、10%ポビドネヨウ素の3つのアプリケーションで消毒し、続いて70%イソプロピルアルコールを行います。</li>
</ol>3. 右側中大脳動脈閉塞
注:MCAOは、以前に説明した16、22、23のように、マクガリーら24およびUluçら.25によって記述された楽器を使用して、修正された技術によって行われる。
<ol><li>外科的ピンセットと湾曲した刃のはさみで首の腹側の正中線で皮膚および表面性筋膜を解剖する。</li>
	<li>筋肉三角形を識別します, ICAからなります, 外耳頸動脈 (ECA) と一般的な頸動脈 (CCA).</li>
	<li>血管手術用のマイクロ鉗子で、右のCCAとICAを迷走神経から慎重に分離します。</li>
	<li>正しい CCA と ICA を公開します。血管手術用のマイクロクリップまたは特別な止血帯を使用して、CCAからICAへの血流を遮断します。血管手術用マイクロシザーを使用してICAを切開(約1mm)します。</li>
	<li>モノフィラメントカテーテル(4-0ナイロン)をICAを介して直接挿入し、右CCAの分岐点から約18.5〜19mmをウィリスの円に入れ、軽度の抵抗に達するまで、MCA26を閉塞させる。</li>
	<li>CCAの分岐の上のICAの周りにリゲート。</li>
	<li>シャム操作制御グループの場合、手順 3.5 および 3.616、22の代わりにナイロンスレッドの挿入を実行します。</li>
	<li>腹腔内注射により0.9%塩化ナトリウムの5mLを投与する。</li>
	<li>縫合によって創傷を閉じ、ラットを回復領域に連れて行く。 注:麻酔が終わる数分後、ラットは目を覚まし、ケージの周りを独立して移動します。</li>
	<li>MCAOの後23時間で、2%のエバンスブルーを生理食アルカリ(4mL/kg)23、26をカニューレ27を介して両方の操作されたグループの尾静脈に注入する。 注:これは、血液脳透過性トレーサーとして使用されます。60分間循環させます。</li>
</ol>4. 梗塞領域の決定
<ol><li>前述の9、15、18、19、26のように MCAO の後の24時間で IZを測定します。 注:体重の20%以上を失った、または発作や片麻痺を発症したラットは、実験から除外されます。</li>
	<li>ラットが自然呼吸を停止するまで、インスピレーションを受けたガス混合物を20%の酸素と80%の二酸化炭素に置き換えることによってラットを安楽死させる。</li>
	<li>はさみと外科用鉗子を使用して、肋骨ケージの下の腹壁を通して5〜6センチメートルの横切開で胸を開きます。</li>
	<li>はさみと外科用鉗子で肋骨のケージの全長に沿って横隔膜切開を行う。</li>
	<li>慎重に肺を置き換え、リブケージを左右28の鎖骨まで切り取る。</li>
	<li>心臓の左心室を通って正常な生理液の200 mLとパーフューズ。</li>
	<li>穿刺またははさみで心臓の右心房を切開します。</li>
	<li>ギロチンを使用して切断を行い、脳組織を収集します。</li>
	<li>虹彩はさみを使用して、両側の後頭蓋表面の遠位縁に前部マグナムからカットします。</li>
	<li>嗅球、腹側表面に沿った神経質なつながり、頭蓋骨の側側表面を脳から分離する。</li>
	<li>頭から脳を取り除きます。</li>
	<li>.009"ステンレススチール、コーティングされていない、単一エッジカミソリブレードを備えた2mm厚い水平セクションを作成することで、6つの脳スライスを作成します。</li>
	<li>37°Cで30分間インキュベートして0.05%TTCで行います。</li>
	<li>顕微鏡スライド上に脳組織を配置し、1600x1600 dpiの解像度でこれらの6脳スライスの光学スキャンを実行します(例えば 、補足1 を参照してください)。</li>
	<li>チャンネルミキサー機能(画像/調整/チャンネルミキサー)を使用して、フォトエディタ(例えばアドビフォトショップCS2)で青いフィルタを追加し、画像をJPEGファイル形式で保存します。 注: 青いフィルターを適用すると、イメージはグレースケールで表示されます。</li>
	<li>保存したイメージを ImageJ 1.37v29,30で開きます。 注 : このコンピュータ プログラムでは、しきい値機能を使用して、黒または白のピクセルを分離して計算します ( 図 1を参照)。</li>
	<li>画像の6つの脳のスライスのそれぞれについて、メインメニューから「ポリゴン選択」ツールを使用して、各半球(右の負傷したイプシララルと左の傷のない矛盾)を別々の画像ファイルとして選択して保存します。</li>
	<li>ImageJ ソフトウェアのメイン メニューから自動しきい値関数を使用して、 イメージ/調整/しきい値を選択して IZ を決定するためのカットオフを設定し、1 つの脳セットの各半球のピクセル数を測定します。 メモ:マクロは、ImageJソフトウェアのこの手順で使用することができます(コードについては 補足2 を参照してください)。カットオフは、白に変換するピクセルと、グレーの陰影に応じて黒に変換するピクセルを決定するための重要なパラメータです(例として 、補足 3 と 補足 4 を 参照)。次に、ImageJ は白と黒のピクセルを比較して IZ を決定します。染色プロトコルとスキャナの設定に基づいて、一定のカットオフ値0.220を使用しました。</li>
	<li>イプシ側および逆側大脳半球(RICH)法13,23を用いて組織膨潤のIZ補正の測定を行う(補足5の例を参照)。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> 注: 梗塞のサイズは、対側半球の割合として評価されます。</li>
</ol>5. 脳浮腫の測定31
注意:BE32、33の測定にはImageJ1.37vを使用してください。
<ol><li>MCAOの後に24時間を測定してください。BE の計算には、左と右半球の体積のデータを使用します (単位)。</li>
	<li>1600x1600 dpi の解像度で光学スキャンを実行します( 例えば、補足 1 を 参照)。</li>
	<li>脳半球を選択し、上記のセクション 4.17-4.19 で説明したように、ImageJ 1.37v で BE を決定するためのカットオフを設定します。</li>
	<li>次の式を使用してRICH法によって計算される、影響を受けない対側半球の標準面積の割合としてBE領域を表現する(補足5の例を参照して、23,34。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> 注: BE の範囲は、対側半球の割合として評価されます。</li>
</ol>6. BBBの中断の決定
<ol><li>MCAO の後で BBB の中断を測定します。</li>
	<li>左右半球を6つのスライスに分け、それぞれをマイクロ遠心分離チューブに入れます。</li>
	<li>50%トリクロロ酢酸の4 mLにおける脳組織の1gの計算に基づいて、トリクロロ酢酸で脳組織の各スライスを均質化する。</li>
	<li>20分間10,000 x g で遠心分離機。</li>
	<li>上清液を1:3に96%エタノールで希釈する。</li>
	<li>分光光度測定ソフトウェアを利用して発光分光度測定を行い、プレートを設置し、次のパラメータを用いてサンプル読み取りを行います:蛍光強度励起波長620nm(帯域幅10nm)および発光波長680nm(帯域幅10nm)23,35;モッドトップ;数肉25;マニュアル100;1秒、1mm振る。 注: 励起波長は 620 nm (帯域幅 10 nm) で、発光波長は 680 nm (帯域幅 10 nm) を使用してください。23,35
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本プロトコルの主な目標は、虚血性損傷の3つの主要なパラメータの一貫した測定を実証することであった:IZ、BEおよびBBB透過性。この分野の以前の研究は、同じサンプルでこれらのパラメータの1つまたは2つを一緒に実行する可能性を実証しました。この3部構成の方法が提供するコスト削減に加えて、手術とその後の安楽死化しなければならない動物の数を制限するより望ましい生物倫理モ?...

世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは脳卒中です。世界的に、虚血性脳卒中は全脳卒中症例の68%を占め、米国では虚血性脳卒中が脳卒中症例1,2の87%を占める。脳卒中の経済的負担は、米国では240億ドル、欧州連合(EU)では450億ユーロに達すると推定されています。脳卒中の動物モデルは、その病態生理学を研究し、評価のための新しい方法を開発し、新しい治療オプションを提案するために必要です4.
虚血性脳卒中は、大脳動脈の閉塞で起こり、通常は中大脳動脈またはその枝の1つである5。したがって、虚血性脳卒中のモデルは、歴史的に中大脳動脈閉塞(MCAO)6、7、8、9、10、11、12を含む。MCAOに続いて、 神経損傷は、2,3,5トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色法13、脳浮腫(BE)を乾燥または半球量14、15、16、および血液脳関門(BBB)透過性を、エバンスブルー17を用いた透過性を測定することによって最も一般的に評価される。
従来のMCAO法は、3つの脳の測定のそれぞれのために別々の脳のセットを使用しています。サンプルサイズが大きい場合、これは、倫理的および財政的な考慮事項を追加して、安楽死させた動物のかなりの数になります。これらのコストを軽減する別の方法は、MCAO後げっ歯類の脳の単一のセットで3つのパラメータすべての測定を含むであろう。
以前の試みは、同じ脳サンプル内のパラメータの組み合わせを測定するために行われています.同時免疫蛍光染色法20 は、他の分子及び生化学的分析21 と同様に、同じ脳試料中でTTC染色後に記載されている。我々は以前に脳浮腫を評価するために脳半球の体積を計算し、同じ脳セット15で梗塞領域を計算するためにTTC染色を行った。
本プロトコルでは、同じ齧歯類脳の中でIZ、BE、BBB透過性を判定することで虚血性脳損傷を測定する改変MCAO技術を提示する。IZはTTC染色法により測定され、BEは半球体積を算出して求められ、BBB透過性は分光法19により得られる。このプロトコルでは、内部頸動脈(ICA)へのモノフィラメントカテーテルの直接挿入および固定に基づく改変MCAOモデルを用いた、および中大脳動脈(MCA)22への血流のさらなる遮断を用いた。この修飾方法は、従来のMCAO法16,22と比較して死亡率および罹患率の低下率を示す。
この新しいアプローチは、MCAO後の神経損傷を測定するための財政的に健全で倫理的なモデルを提供します。虚血性脳損傷の主なパラメータのこの評価は、その病態生理学を包括的に調査するのに役立ちます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは虚血性脳卒中である。歴史的に、虚血性脳卒中を刺激するために使用される動物モデルは、中大脳動脈閉塞(MCAO)を含む。梗塞領域、脳浮腫および血液脳関門(BBB)の内訳は、MCAO後の脳損傷の程度を反映するパラメータとして測定される。この方法の重要な制限は、これらの測定は通常、異なるラットの脳サンプルで得られ、適切なサンプルサイズのために安楽死させられる必要がある多数のラットのために倫理的および財政的負担を引き起こします。ここでは、同じラット脳の中で梗塞領域、脳浮腫およびBBB透過性を測定することによってMCAOに続く脳損傷を正確に評価する方法を提示する。この新しい技術は、脳卒中の病態生理を評価するより効率的な方法を提供する。

梗塞ゾーン測定
独立サンプルt-テストでは、永久的MCAOを受けた19匹のラットが、3.57ラット対シャム=0.31%± ±1.9、t(28.49)=7.56、p<0.01(図2)と比較して脳梗塞容積が有意に増加したことを示した(図2A)。データは、SDの反側半球±平均パーセントとして表されます。
脳浮腫測定
?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K ビュー.  Ben-Gurion University of the Negev. このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。

ビデオ: Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

神経科学

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

加圧齧歯動物に及ぼす影響の爆発による頭部外傷の中間の大脳動脈

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

細胞バリアの完全性を評価するための経内皮抵抗測定

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

著者スポットライト:細胞バリアの完全性を評価するためのTEER検出の応用 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

ヒト多能性幹細胞由来の3次元血液脳関門モデル

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

著者スポットライト:In vitro血液脳関門モデルを使用したアルツハイマー病の調査に向けた個別化アプローチ 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...