Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk do Departamento de Fisiologia, Faculdade de Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ucrânia por seu apoio e contribuições úteis às nossas discussões. Os dados obtidos fazem parte da tese de doutorado de Ruslan Kuts.

Os seguintes procedimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e Tóquio e as Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos também foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.
1. Preparando ratos para o procedimento experimental
<ol><li>Selecione ratos adultos machos Sprague-Dawley sem patologia atolizada, cada um pesando entre 300 e 350 g.</li>
	<li>Mantenha todos os ratos à temperatura ambiente a 22 °C, com 12 horas de ciclos claros e escuros antes do experimento.</li>
	<li>Certifique-se de que alimentos e água estão disponíveis ad libitum.</li>
	<li>Realizar todos os procedimentos entre 6:00.m e 14:00.m.</li>
</ol>2. Preparando ratos para cirurgia
<ol><li>Anestesiar os ratos por 30 minutos com isoflurane (4% para indução e 2% para manutenção) e 24% de oxigênio (1,5 L/min).<ol>
<li>Teste o nível de anestesia nos ratos, garantindo que eles não tenham um reflexo de retirada do pedal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insira o cateter de calibre 24 na veia da cauda. NOTA: O aquecimento da cauda para vasodilatação não é realizado.<ol>
<li>Coloque os ratos sobre a mesa em uma posição supina. Use fita médica para fixar todos os quatro membros dos ratos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a sonda para medir a temperatura no reto do rato antes da cirurgia.</li>
	<li>Durante o procedimento, mantenha uma placa de aquecimento para suportar uma temperatura corporal do núcleo de 37 °C.</li>
	<li>Adicione pomada em ambos os olhos do rato para proteção.</li>
	<li>Raspe a área cirúrgica e desinfete com três aplicações de 10% de povidone-iodo seguido de 70% de álcool isopropílico.</li>
</ol>3. Oclusão da artéria cerebral do lado direito
NOTA: A MCAO é realizada por uma técnica modificada, conforme descrito anteriormente16,22,23, com o uso de instrumentos descritos por McGarry et al.24 e Uluç et al.25.
<ol><li>Dissecar a pele e a fáscia superficial na linha média ventral do pescoço com pinças cirúrgicas e tesouras com lâminas curvas.</li>
	<li>Identificar o triângulo muscular, composto pelo ICA, artéria carótida externa (ECA) e artéria carótida comum (CCA).</li>
	<li>Separe cuidadosamente o CCA direito e o ICA do nervo vago com microforceps para cirurgia vascular.</li>
	<li>Exponha a CCA direita e o ICA. Bloqueie o fluxo sanguíneo proveniente da CCA para o ICA usando micro-clipes ou torniquetes especiais para cirurgia vascular. Faça uma incisão (aproximadamente 1 mm) no ICA usando microscisores para cirurgia vascular.</li>
	<li>Insira um cateter monofilamento (4-0 nylon) diretamente através do ICA, cerca de 18,5-19 mm do ponto de bifurcação da CCA direita no círculo de Willis até atingir uma leve resistência, para ocluir a MCA26.</li>
	<li>Ligate em torno do ICA acima da bifurcação da CCA.</li>
	<li>Para o grupo de controle operado por farsa, realize uma inserção de linha de nylon em vez das etapas 3.5 e 3.616,22.</li>
	<li>Administre 5 mL de cloreto de sódio de 0,9% por injeção intraperitoneal.</li>
	<li>Feche a ferida por sutura e leve o rato para uma área de recuperação. NOTA: Alguns minutos após o fim da anestesia, o rato acordará e se moverá independentemente ao redor da gaiola.</li>
	<li>Às 23 horas após mcao, injete 2% de Evans azul em soro fisiológico (4 mL/kg)23,26 na veia traseira para ambos os grupos operados através de uma cânula27. NOTA: Isto é usado como um rastreador de permeabilidade cérebro-sangue. Deixe circular por 60 minutos.</li>
</ol>4. Determinação da zona de infarto
<ol><li>Medida IZ às 24h após MCAO como descrito anteriormente9,15,18,19,26. NOTA: Ratos que perderam mais de 20% de seu peso ou desenvolveram convulsões ou hemiplegia são excluídos do experimento.</li>
	<li>Eutanize o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% de oxigênio e 80% de dióxido de carbono até que o rato deixe de respirar espontaneamente.</li>
	<li>Abra o peito com uma incisão lateral de 5-6 cm através da parede abdominal sob a caixa torácica usando tesouras e fórceps cirúrgicos.</li>
	<li>Realize uma incisão diafragmática ao longo de toda a extensão da caixa torácica com tesoura e fórceps cirúrgicos.</li>
	<li>Deslocando cuidadosamente os pulmões, cortando a caixa torácica até a clavícula nos lados direito e esquerdo28.</li>
	<li>Perfuse com 200 mL de soro fisiológico normal através do ventrículo esquerdo do coração.</li>
	<li>Puna ou incise o átrio direito do coração com uma tesoura.</li>
	<li>Realizar decapitação usando uma guilhotina e coletar tecido cerebral.</li>
	<li>Usando uma tesoura de íris, cortada do foie magnum até a borda distal da superfície posterior do crânio em ambos os lados.</li>
	<li>Separe as lâmpadas olfativas, conexões nervosas ao longo da superfície ventral e superfície dorsal do crânio do cérebro.</li>
	<li>Remova o cérebro da cabeça.</li>
	<li>Produza 6 fatias cerebrais criando seções horizontais de 2 mm de espessura com uma lâmina de barbear de 0,009", sem revestimento, de borda única.</li>
	<li>Incubar por 30 min a 37 °C em 0,05% TTC.</li>
	<li>Coloque o tecido cerebral nos slides do microscópio e realize a varredura óptica dessas 6 fatias cerebrais com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).</li>
	<li>Adicione um filtro azul com um editor de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop CS2) usando a função Channel Mixer(Image > Adjustments > Channel Mixer) e salve a imagem como um formato de arquivo JPEG. NOTA: Após a aplicação do filtro azul, a imagem aparecerá em escala de cinza.</li>
	<li>Abra a imagem salva em ImageJ 1.37v29,30. NOTA: Este programa de computador usa uma função limiar para isolar e calcular os pixels que são preto ou branco (ver Figura 1).</li>
	<li>Para cada uma das 6 fatias cerebrais da imagem, selecione e salve cada hemisfério (ipsilateral direito ferido e contralateral inin ferido) como um arquivo de imagem separado usando a ferramenta "seleção de polígonos" do menu principal.</li>
	<li>Defina o limite para determinar o IZ usando uma função de limiar automático do menu principal do software ImageJ selecionando Image > Adjust > Threshold, e meça o número de pixels em cada hemisfério de um único conjunto cerebral. NOTA: Macros podem ser usadas para esta etapa no software ImageJ (ver Suplemento 2 para o código). O corte é um parâmetro crítico para determinar quais pixels converter em branco e que se converter em preto dependendo do tom de cinza (ver Suplemento 3 e Suplemento 4 como exemplos). ImageJ então compara pixels brancos e pretos para determinar IZ. Com base no protocolo de coloração e configurações do scanner, usamos um valor de corte constante de 0,220.</li>
	<li>Realizar a medição da correção do IZ para inchaço tecidual utilizando as Razões dos Hemisférios Cerebrais Ipsilaterais e Contralateral (RICH) método13,23 (ver exemplo no Suplemento 5). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> NOTA: O tamanho do infarto é avaliado como uma porcentagem do hemisfério contralateral.</li>
</ol>5. Determinação do edema cerebral31
NOTA: Use ImageJ 1.37v para medição de BE32,33.
<ol><li>Meça BE 24 h após MCAO. Para cálculo do BE, utilize os dados do volume do hemisfério esquerdo e direito (em unidades).</li>
	<li>Realize a digitalização óptica com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).</li>
	<li>Selecione hemisférios cerebrais e defina o corte para determinar BE com ImageJ 1.37v, conforme descrito acima nas seções 4.17-4.19.</li>
	<li>Expresse a área BE como uma porcentagem das áreas padrão do hemisfério contralateral não afetado, calculada pelo método RICH utilizando a equação seguinte (ver exemplo no Suplemento 5)23,34. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> NOTA: A extensão do BE é avaliada como uma porcentagem do hemisfério contralateral.</li>
</ol>6. Determinação do rompimento do BBB
<ol><li>Medir o rompimento do BBB 24 h após MCAO.</li>
	<li>Divida os hemisférios direito e esquerdo em seis fatias e coloque cada uma em um tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Homogeneize cada fatia do tecido cerebral em ácido tricloroacético, com base no cálculo de 1 g de tecido cerebral em 4 mL de ácido tricloroacético de 50%.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g por 20 min.</li>
	<li>Líquido supernacido diluído 1:3 com 96% de etanol.</li>
	<li>Realize a espectrofotometria de luminescência utilizando o software de espectrofotometria, instalando a placa e realizando uma leitura amostral usando os seguintes parâmetros: Comprimento de onda de intensidade de fluorescência de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm)23,35 ; Mod top; Número Carne 25; Manual 100; Tremendo 1 segundo, 1 mm. NOTA: Use um comprimento de onda de excitação de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm). 23,35
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O objetivo principal do presente protocolo foi demonstrar medições consistentes de três parâmetros principais de lesão isquêmica: permeabilidade IZ, BE e BBB. Estudos anteriores neste campo demonstraram a possibilidade de realizar um ou dois desses parâmetros juntos na mesma amostra. Além da redução de custos que este método de três partes oferece, ele também fornece um modelo bioético mais desejável que limita o número de animais que devem ser operados e, posteriormente, eutanizados. Como em todas as té...

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC. Globalmente, o AVC isquêmico representa 68% de todos os casos de AVC, enquanto nos Estados Unidos o AVC isquêmico é responsável por 87% dos casos de acidente vascular cerebral1,2. Estima-se que o ônus econômico do AVC atinja US$ 34 bilhões nos Estados Unidos2 e € 45 bilhões na União Europeia3. Modelos animais de AVC são necessários para estudar sua fisiopatologia, desenvolver novos métodos de avaliação e propor novas opções terapêuticas4.
O AVC isquêmico ocorre com a oclusão de uma artéria cerebral grave, geralmente a artéria cerebral média ou um de seus ramos5. Assim, os modelos de AVC isquêmico envolveram historicamente a oclusão da artéria cerebral média (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Seguindo MCAO, a lesão neurológica é mais comumente avaliada pela medição da zona de infarto (IZ) usando um método de coloração de cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) de 2,3,5, usando o método de coloração13, edema cerebral (BE) usando secagem ou cálculo dos volumes hemisféricos14,15,16e permeabilidade da barreira cerebral sanguínea (BBB) por uma técnica de espectrometria usando a coloração azul evans17,18,19.
O método tradicional de MCAO usa conjuntos separados de cérebros para cada uma das três medidas cerebrais. Para um grande tamanho amostral, isso resulta em um número significativo de animais eutanizados, com considerações éticas e financeiras adicionais. Um método alternativo para aliviar esses custos envolveria medições de todos os três parâmetros em um único conjunto de cérebros de roedores pós-MCAO.
Tentativas anteriores foram feitas para medir combinações de parâmetros na mesma amostra cerebral. Métodos simultâneos de coloração imunofluorescente20, bem como outras análises moleculares e bioquímicas21 foram descritos após a coloração de TTC na mesma amostra cerebral. Calculamos anteriormente os volumes do hemisfério cerebral para avaliar o edema cerebral e realizamos a coloração do TTC para calcular a zona de infarto no mesmo conjunto cerebral15.
No presente protocolo, apresentamos uma técnica modificada de MCAO que mede a lesão cerebral isquêmica através da determinação da permeabilidade de IZ, BE e BBB no mesmo conjunto de cérebros de roedores. O IZ é medido pela coloração TTC, o BE é determinado pelo cálculo do volume hemisférico, e a permeabilidade do BBB é obtida pelos métodos de espectrometria19. Neste protocolo, utilizou-se um modelo MCAO modificado, baseado na inserção direta e fixação do cateter monofilamento na artéria carótida interna (ICA) e posterior bloqueio do fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (MCA)22. Este método modificado mostra uma taxa reduzida de mortalidade e morbidade em comparação com o método tradicional de MCAO16,22.
Esta nova abordagem fornece um modelo financeiro e ético para medir lesões neurológicas após mcao. Essa avaliação dos principais parâmetros da lesão cerebral isquêmica ajudará a investigar de forma abrangente sua fisiopatologia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC isquêmico. Historicamente, um modelo animal usado para estimular o AVC isquêmico envolve o oclusão da artéria cerebral média (MCAO). A zona infarto, o edema cerebral e a quebra da barreira hematoencefálica (BBB) são medidos como parâmetros que refletem a extensão da lesão cerebral após o MCAO. Uma limitação significativa para este método é que essas medidas são normalmente obtidas em diferentes amostras cerebrais de ratos, levando a encargos éticos e financeiros devido ao grande número de ratos que precisam ser eutanizados para um tamanho amostral adequado. Aqui apresentamos um método para avaliar com precisão a lesão cerebral após mcao medindo zona de infarto, edema cerebral e permeabilidade BBB no mesmo conjunto de cérebros de ratos. Esta nova técnica fornece uma maneira mais eficiente de avaliar a fisiopatologia do AVC.

Medição da zona de infarto
Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram um aumento significativo no volume de infarto cerebral em comparação com os 16 ratos operados por vergonha (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (ver Figura 2A).). Os dados são expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Vídeo: Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Medição da resistência transendotelial para avaliar a integridade da barreira celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor em destaque: Aplicações da detecção TEER para avaliar a integridade da barreira celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Um modelo 3D de barreira hematoencefálica derivado de células-tronco pluripotentes humanas

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor em destaque: uma abordagem personalizada para investigar a doença de Alzheimer usando um modelo de barreira hematoencefálica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...