Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko y Evgenia Goncharyk del Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Ecología y Medicina, Oles Honchar, Universidad Dnipro, Dnipro, Ucrania por su apoyo y contribuciones útiles a nuestros debates. Los datos obtenidos forman parte de la tesis doctoral de Ruslan Kuts.

Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.
1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental
<ol><li>Seleccione ratas macho sprague-dawley adultas sin patología excesiva, cada una con un peso de entre 300 y 350 g.</li>
	<li>Mantenga todas las ratas a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 horas de ciclos claros y oscuros antes del experimento.</li>
	<li>Asegúrese de que los alimentos y el agua estén disponibles ad libitum.</li>
	<li>Realice todos los procedimientos entre las 6:00 a.m. y las 2:00 p.m.</li>
</ol>2. Preparación de ratas para cirugía
<ol><li>Anestesiar las ratas durante 30 min con isoflurano (4% para inducción y 2% para mantenimiento) y 24% oxígeno (1,5 L/min).<ol>
<li>Pruebe el nivel de anestesia en las ratas asegurándose de que no tengan un reflejo de abstinencia del pedal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserte el catéter del calibre 24 en la vena de la cola. NOTA: El calentamiento de la cola para vasodilatación no se realiza.<ol>
<li>Coloque las ratas sobre la mesa en posición supina. Utilice cinta médica para colocar las cuatro extremidades de las ratas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la sonda para medir la temperatura en el recto de la rata antes de la cirugía.</li>
	<li>Durante el procedimiento, mantenga una placa de calentamiento para soportar una temperatura corporal del núcleo de 37 °C.</li>
	<li>Agregue ungüento en ambos ojos de la rata para protegerse.</li>
	<li>Afeitar el área quirúrgica y desinfectar con tres aplicaciones de 10% povidone-yodo seguido de 70% alcohol isopropílico.</li>
</ol>3. Oclusión de la arteria cerebral media derecha
NOTA: MCAO se realiza mediante una técnica modificada, como se describió anteriormente16,22,23, con el uso de instrumentos descritos por McGarry et al.24 y Uluç et al.25.
<ol><li>Disecciona la piel y la fascia superficial en la línea media ventral del cuello con pinzas quirúrgicas y tijeras con cuchillas curvas.</li>
	<li>Identificar el triángulo muscular, formado por el ICA, la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida común (CCA).</li>
	<li>Separe cuidadosamente el CCA y el ICA correctos del nervio vago con microaplicaps para la cirugía vascular.</li>
	<li>Exponga el CCA y el ICA correctos. Bloquee el flujo sanguíneo que proviene de la CCA al ICA utilizando micro-clips o torniquetes especiales para cirugía vascular. Haga una incisión (aproximadamente 1 mm) en el ICA usando microscisores para cirugía vascular.</li>
	<li>Inserte un catéter monofilamento (nylon 4-0) directamente a través del ICA, aproximadamente 18,5-19 mm desde el punto de bifurcación de la CCA derecha en el círculo de Willis hasta alcanzar una resistencia leve, para ocultar el MCA26.</li>
	<li>Ligar alrededor del ICA por encima de la bifurcación de CCA.</li>
	<li>Para el grupo de control operado por sham, realice una inserción de hilo de nylon en lugar de los pasos 3.5 y 3.616,22.</li>
	<li>Administrar 5 ml de cloruro de sodio al 0,9% mediante inyección intraperitoneal.</li>
	<li>Cierre la herida por sutura y lleve a la rata a un área de recuperación. NOTA: Unos minutos después del final de la anestesia, la rata se despertará y se moverá independientemente alrededor de la jaula.</li>
	<li>A las 23 h después de MCAO, inyectar 2% Evans azul en solución salina (4 mL/kg)23,26 en la vena trasera para ambos grupos operados a través de una cánula27. NOTA: Esto se utiliza como un trazador de permeabilidad cerebro-sangre. Dejar circular durante 60 minutos.</li>
</ol>4. Determinación de la zona infarta
<ol><li>Medir IZ a las 24 h después de MCAO como se describió anteriormente9,15,18,19,26. NOTA: Las ratas que perdieron más del 20% de su peso o desarrollaron convulsiones o hemiplejia están excluidas del experimento.</li>
	<li>Eutanasia a la rata reemplazando la mezcla de gas inspirada por un 20% de oxígeno y un 80% de dióxido de carbono hasta que la rata deje de respirar espontáneamente.</li>
	<li>Abra el pecho con una incisión lateral de 5-6 cm a través de la pared abdominal debajo de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.</li>
	<li>Realice una incisión diafragmática a lo largo de toda la longitud de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.</li>
	<li>Desplazar cuidadosamente los pulmones, cortar a través de la caja torácica hasta la clavícula en los lados derecho e izquierdo28.</li>
	<li>Perfuso con 200 ml de solución salina normal a través del ventrículo izquierdo del corazón.</li>
	<li>Pinchazo o incienso el atrio derecho del corazón con tijeras.</li>
	<li>Realiza la decapitación usando una guillotina y recoge tejido cerebral.</li>
	<li>Usando tijeras de iris, corta desde el antenombre hasta el borde distal de la superficie posterior del cráneo en ambos lados.</li>
	<li>Separa las bombillas olfativas, las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral y la superficie dorsal del cráneo del cerebro.</li>
	<li>Extraiga el cerebro de la cabeza.</li>
	<li>Produzca 6 rebanadas cerebrales creando secciones horizontales de 2 mm de espesor con una hoja de afeitar de .009", sin recubrimiento y de un solo borde.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C en 0.05% TTC.</li>
	<li>Coloque el tejido cerebral en las diapositivas del microscopio y realice la exploración óptica de estas 6 rebanadas cerebrales con una resolución de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1 por ejemplo).</li>
	<li>Añada un filtro azul con un editor de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop CS2) utilizando la función Mezclador de canales(Imagen > Ajustes > Mezclador de canales)y guarde la imagen como formato de archivo JPEG. NOTA: Después de aplicar el filtro azul, la imagen aparecerá en escala de grises.</li>
	<li>Abra la imagen guardada en ImageJ 1.37v29,30. NOTA: Este programa informático utiliza una función de umbral para aislar y calcular los píxeles que son en blanco o negro (consulte la figura 1).</li>
	<li>Para cada uno de los 6 sectores cerebrales de la imagen, seleccione y guarde cada hemisferio (ipsilateral lesionado derecho e contralateral izquierdo sin lesiones) como un archivo de imagen independiente utilizando la herramienta "selección de polígonos" del menú principal.</li>
	<li>Establezca el límite para determinar IZ mediante una función de umbral automático en el menú principal del software ImageJ seleccionando Imagen > Ajustar > Umbraly mida el número de píxeles en cada hemisferio de un solo conjunto cerebral. NOTA: Las macros se pueden utilizar para este paso en el software ImageJ (consulte suplemento 2 para el código). El corte es un parámetro crítico para determinar qué píxeles convertir al blanco y qué convertir al negro dependiendo del tono de gris (consulte Suplemento 3 y Suplemento 4 como ejemplos). A continuación, ImageJ compara píxeles blancos y negros para determinar IZ. Basándonos en el protocolo de tinción y la configuración del escáner, usamos un valor de corte constante de 0,220.</li>
	<li>Realizar la medición de la corrección de IZ para la hinchazón del tejido utilizando las relaciones de los hemisferios cerebrales ipsilaterales y contralaterales (RICH) método13,23 (ver ejemplo en suplemento 5). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> NOTA: El tamaño infarto se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.</li>
</ol>5. Determinación del edema cerebral31
NOTA: Utilice ImageJ 1.37v para la medición de BE32,33.
<ol><li>Mida BE 24 h después de MCAO. Para el cálculo de BE, utilice los datos del volumen del hemisferio izquierdo y derecho (en unidades).</li>
	<li>Realice el escaneo óptico con una resolución de 1600x1600 ppp (consulte suplemento 1, por ejemplo).</li>
	<li>Seleccione los hemisferios cerebrales y establezca el corte para determinar BE con ImageJ 1.37v, como se describió anteriormente en las secciones 4.17-4.19.</li>
	<li>Exprese el área BE como porcentaje de las áreas estándar del hemisferio contralateral no afectado, calculada por el método RICH utilizando la siguiente ecuación (véase el ejemplo en Suplemento 5)23,34. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> NOTA: La extensión de BE se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.</li>
</ol>6. Determinación de la interrupción del BBB
<ol><li>Mida la interrupción de BBB 24 h después de MCAO.</li>
	<li>Divida los hemisferios derecho e izquierdo en seis rebanadas y coloque cada uno en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Homogeneizar cada rebanada del tejido cerebral en ácido tricloroacético, basado en el cálculo de 1 g de tejido cerebral en 4 ml de ácido tricloroacético al 50%.</li>
	<li>Centrífuga a 10.000 x g durante 20 min.</li>
	<li>Diluir líquido sobrenadante 1:3 con 96% etanol.</li>
	<li>Realice espectrofotometría de luminiscencia utilizando software de espectrofotometría, instalando la placa y realizando una lectura de muestra utilizando los siguientes parámetros: Longitud de onda de excitación de intensidad de fluorescencia de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm)23,35 ; Mod superior; Número Carne 25; Manual 100; Agitar 1 s, 1 mm. NOTA: Utilice una longitud de onda de excitación de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm). 23,35
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal del presente protocolo era demostrar mediciones consistentes de tres parámetros principales de lesión isquémica: IZ, BE y BBB permeabilidad. Estudios previos en este campo han demostrado la posibilidad de realizar uno o dos de estos parámetros juntos en la misma muestra. Además de la reducción de costes que ofrece este método de tres partes, también proporciona un modelo bioético más deseable que limita el número de animales que deben ser operados y posteriormente eutanasiados. Al igual q...

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular isquémico representa el 68% de todos los casos de accidente cerebrovascular, mientras que en los Estados Unidos el accidente cerebrovascular isquémico representa el 87% de los casos de accidente cerebrovascular1,2. Se estima que la carga económica del ictus alcanza los 34.000 millones de dólares en los Estados Unidos2.000 millones de dólares y los 45.000 millones de euros en la Unión Europea3. Los modelos animales de ictus son necesarios para estudiar su fisiopatología, desarrollar nuevos métodos de evaluación y proponer nuevas opciones terapéuticas4.
El accidente cerebrovascular isquémico ocurre con oclusión de una arteria cerebral importante, generalmente la arteria cerebral media o una de sus ramas5. Así, los modelos de accidente cerebrovascular isquémico han implicado históricamente oclusión arterial cerebral media (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Después de MCAO, las lesiones neurológicas se evalúan con mayor frecuencia midiendo la zona infarta (IZ) utilizando un método de tinción de cloruro de 2,3,5 tripfeniltrazolium (TTC)13,edema cerebral (BE) usando14, 15,16,y la permeabilidad de la barrera hemisférica de la barrera hemisférica de la sangre (BBB) mediante una técnica de espectrometría utilizando las manchas azules evans17,18,19.
El método tradicional MCAO utiliza conjuntos separados de cerebros para cada una de las tres mediciones cerebrales. Para un gran tamaño de muestra, esto resulta en un número significativo de animales eutanasiados, con consideraciones éticas y financieras añadidas. Un método alternativo para aliviar estos costos implicaría mediciones de los tres parámetros en un solo conjunto de cerebros de roedores post-MCAO.
Se han realizado intentos anteriores para medir combinaciones de parámetros en la misma muestra cerebral. Se han descrito métodos de tinción inmunofluorescentes simultáneas20, así como otros análisis moleculares y bioquímicos21 después de la tinción de TTC en la misma muestra cerebral. Hemos calculado previamente los volúmenes del hemisferio cerebral para evaluar el edema cerebral y hemos realizado manchas de TTC para calcular la zona infarta en el mismo cerebro establecido15.
En el protocolo actual, presentamos una técnica de MCAO modificada que mide la lesión cerebral isquémica a través de la determinación de la permeabilidad iz, BE y BBB en el mismo conjunto de cerebros de roedores. Iz se mide mediante tinción TTC, BE se determina calculando el volumen hemisférico, y la permeabilidad BBB se obtiene mediante métodos de espectrometría19. En este protocolo, utilizamos un modelo MCAO modificado, basado en la inserción directa y fijación del catéter monofilamento en la arteria carótida interna (ICA) y el bloqueo adicional del flujo sanguíneo a la arteria cerebral media (MCA)22. Este método modificado muestra una disminución de la tasa de mortalidad y morbilidad en comparación con el método tradicional MCAO16,22.
Este nuevo enfoque proporciona un modelo financieramente sólido y ético para medir lesiones neurológicas después de MCAO. Esta evaluación de los principales parámetros de la lesión cerebral isquémica ayudará a investigar exhaustivamente su fisiopatología.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular isquémico. Históricamente, un modelo animal utilizado para estimular el accidente cerebrovascular isquémico implica oclusión arterial cerebral media (MCAO). La zona infarta, el edema cerebral y la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) se miden como parámetros que reflejan el alcance de la lesión cerebral después del MCAO. Una limitación significativa a este método es que estas mediciones se obtienen normalmente en diferentes muestras de cerebro de rata, lo que conduce a cargas éticas y financieras debido al gran número de ratas que necesitan ser eutanasiadas para un tamaño de muestra adecuado. Aquí presentamos un método para evaluar con precisión las lesiones cerebrales después de MCAO midiendo la zona infarta, el edema cerebral y la permeabilidad bbb en el mismo conjunto de cerebros de ratas. Esta novedosa técnica proporciona una manera más eficiente de evaluar la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Medición de zona infarto
Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en el volumen de infartos cerebrales en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=7.49% ± 3.57 contra. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (véase la Figura 2A)). Los datos se expresan como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.

Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K vistas.  Ben-Gurion University of the Negev. Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Investigación

Neurociencias

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Medición de la resistencia transendotelial para evaluar la integridad de la barrera celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor destacado: Aplicaciones de la detección de TEER para evaluar la integridad de la barrera celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Author Spotlight: A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...