我々のプロトコルは、レーザー照射を用いてラットの外傷性脳損傷を作成し、運動皮質に焦点の影響を与えるための新しい方法論を提供する。この技術の主な利点は、梗塞領域の低い変動性、低い死亡率、および専門家のハンドラーを必要としない手順の相対的な単純性です。この手順を実証することは、私たちの研究室の研究者であるドミトリー・ナタネルです。
レーザー誘発脳損傷を行うために、まず20、300〜350グラムのスプレイグ・ドーリーラットをレーザー群に割り当て、20を対照シャム操作群に割り当てる。離脱反射に対する応答の欠如を確認した後、直腸温度調節加熱パッドに1匹のラットを置き、切開の周りに約2センチメートルの無毛マージンを持つ傷害部位から十分な髪を取り除くために剃毛を使用する。70%エタノールで露出した皮膚を消毒し、立体性ヘッドホルダーの傾向にラットを置きます。
頭皮の横反射がブレグマとラムダの間の領域を露出できるように、3センチメートルの切開を行います。頭蓋骨から2ミリメートルの距離で1064ナノメートルのピーク波長を持つNd:YAGレーザーを保持し、右半球の上の頭蓋骨の露出領域に1秒のパルス持続時間で50ジュール倍の10ポイントを投与する。レーザー損傷が届いた後、装置からラットを取り出し、3-0シルク外科縫合糸で頭皮を閉じます。
その後、完全な債務まで監視してケージにラットを置きます。処置の24時間後、43点スコアリングシステムを用いて神経学的重症度スコアを評価する。神経学的な欠陥、行動障害、ビームバランスタスク、反射神経のために動物をテストし、より重度の障害のためにより高いスコアを割り当てます。
評価後、各実験から脳を収穫し、標準的なプロトコルに従って動物を制御する。脳梗塞の体積を評価するには、収穫した脳を6つの2ミリメートルの厚さのコロナスライスに切り分け、各スライスを摂氏37度で30分間0.05%TTCでインキュベートする。染色後、1600 x 1600 ドット/インチの解像度の光学式スキャナーでこのスライスをスキャンします。
固定脳スライスの染色されていない領域は梗塞と定義されます。血液脳関門破損の発生率を評価するために、レーザー誘発傷害の24時間後に、生理食塩水の1キログラム当たり4ミリリットルで希釈した2%エバンスブルー染料を含む注射器をロードし、カニューレートされた尾静脈を介して負傷および対照ラットに静脈内に溶液を送達する。外科用ピンセットとはさみを使用して最初の動物の胸を開く前に、溶液を1時間循環させます。
右心房から無色の拡散液が観察されるまで、110ミリメートルの水銀圧で左心室を介して冷却された0.9%生理食動で露出した心臓を浸透させる。次に、脳を収穫し、2ミリメートルのロストラル尾のスライスを得る。左脳スライスを右脳スライスから分離して、負傷した半球と負傷していない半球を別々に評価できるようにし、サンプルの重量を量る。
乳鉢と害虫を使用してサンプルを均質化し、24時間トリクロロ酢酸で組織サンプルをインキュベートします。翌日、均質化された脳組織サンプルをGと室温の10,000倍で20分間遠心分離し、上澄みの1ミリリットルを1~3倍の割合で96%エタノールの1.5ミリリットル混合する。次に、620ナノメートルの励起で蛍光検出器を用い、680ナノメートルの発光波長を用いて血液脳関門破損を評価する。
組織学的分析によって観察されるように、エバンス青染色はレーザーおよびMCAOのモデル動物の脳損傷の発生率を明らかにするために使用することができる。この代表的な分析では、コントロール群または実験群のいずれにも死亡またはくも膜下出血は登録されず、MCAO群は死亡率とくも膜下出血の両方の20%率を有していた。両群からのラットの相対体温変化も同様であったが、両群の変動性の差にも関わらず。
神経学的重症度スコアは、シャム操作対照群と比較して、レーザーおよびMCAOモデルの両方で有意に悪化した。脳損傷にレーザー誘発はまた、シャム作動制御群と比較して標的半球の梗塞容積の有意な増加を引き起こした。しかし、レーザーモデルの梗塞容積はMCAO技術により負傷した動物に比べて小さかった。
レーザー誘発性脳損傷モデルとシャム操作対照群との間には脳浮腫の違いは認められなかった。しかし、レーザーモデルとMCAOの負傷群との間には脳浮腫に有意な差があった。シャム操作対照群と比較して、レーザー誘発脳損傷およびMCAO技術は共に、非傷害および標的半球における血液脳関門破壊の有意な増加を引き起こした。
このモデルを試みている間、正確に運動皮質領域をターゲットにし、エネルギー、照射されるポイントの数、および総博覧会時間を標準化することを忘れないでください。この手順に従って、ビームウォーキング、フロエデルト、およびその他の評価などの幅広い行動テストを行うことができます。
