この方法により、腎線維症などの広範囲の病理的状態を有するマウスの腎臓にマイクロRNA発現を提供することができる。この技術の主な利点は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスを使用して、高精度かつ感度でマイクロRNA発現プロファイリングを可能にすることです。恥ずかしの手術を行うには、外科的なはさみとピンセットを使用して腹部の皮膚を切開し、膀胱から肋骨の左端まで筋肉と腹膜を切断する。
PBSで綿棒2本を湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開します。
一方的な尿道閉塞、またはUUOを行うには、腹部の皮膚に切開を行い、恥の手術のために示されるように筋肉と腹膜を切断します。マウスの下に2.5ミリリットルの注射器を置きます。PBSで綿棒を2本湿らせ、ピンセットで腸を慎重に横に引っ張り、綿棒を置いて左尿管を識別します。
ピンセットを使用して左腎臓を持ち上げます。4-0シルクを使用して、約1センチメートル離れた2つの場所で左尿管をリゲートします。2つの結紮の中心点で尿管を切り、4-0ナイロン縫合糸を使用して腹膜と切開部を閉じます。
腹膜を切断した後、先に示したように、ピンセットでそれを持ち上げ、上端で横方向の切開を行うために外科用のはさみを使用し、その後、肋骨の最も低い端に沿って切開を続ける。左腎臓を識別し、腎臓が黄白になるまでPBSでそれを還流します。左腎動脈と静脈を外科用ハサミで切断して腎臓を取り除き、ペトリ皿に入れ、PBSで慎重に洗います。
外科用ハサミとピンセットで腎臓を約10ミリグラムのサンプルに切り、腎臓の各部分を独自の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブのキャップを閉じます。シリコーンホモジナイザーに腎臓サンプルを入れ、フェニル/グアニジンベースのリシス試薬を700マイクロリットル添加します。ホモジナイザーの害虫を腎臓サンプルに対してゆっくりと押してねじり、ホモジナイズを均質化します。
サンプルが溶解試薬に完全に溶解するまで押し、ねじれを繰り返します。さらに試料を均質化するには、ホモゲン化したリセートを生体高分子スピンカラムに移し、Gを14,000回Gで3分間回転させ、沈殿したライセートを未使用の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブ内のライセートと140マイクロリットルのクロロホルムを組み合わせ、チューブをしっかりとキャップします。
ライセートとクロロホルムを混合するには、チューブを15回反転する。サンプルを室温で2〜3分間インキュベートし、摂氏4度で15分間Gの12,000倍に回転させます。沈殿物を乱すことなく、上澄み液を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、100%エタノールの体積の1.5倍を加えます。
混合物を5秒間渦液します。サンプル700マイクロリットルを2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに積み込みます。カラムキャップを閉じ、Gの15,000倍の位置で15秒間回転させ、集塵したライセートを回収管に捨てる。
2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに700マイクロリットルの洗浄バッファー1を加えてサンプルを十分に洗浄します。その後、遠心分離を繰り返し、コレクションチューブを捨てる。洗浄ごとに500マイクロリットルの洗浄バッファー2で2回洗浄を繰り返します。
最後の洗浄後、膜固定スピンカラムを2ミリリットルのコレクションチューブで15,000倍Gで1分間回転させ、沈殿したライセートを捨てる。膜固定スピンカラムを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。カラムに30マイクロリットルのRNaseフリー水を加えてRNA全体を溶解し、カラムキャップを閉じ、室温で5分間放置します。
その後、15,000回Gで1分間列を回転させます。全RNAを含むサンプルを氷上の新しいマイクロ遠心分離管に移し、分光光測定により全RNAの濃度を測定します。原稿の方向に従ってマスターミックス溶液を準備し、8ウェルチューブストリップの各チューブに8マイクロリットルを追加します。
RNAの全密度を調整した後、各チューブに12マイクロリットルのRNAのアリコートを入れ、キャップを閉じます。チューブを15秒間遠心分離します。チューブをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートします。
終了したら、すぐにcDNAの合成のために摂氏95度で5分間インキュベートします。cDNAを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、蒸留水で10回希釈します。渦および遠心分離管を5秒間、次に、テキスト原稿に記載されているように定量的リアルタイムPCRを行う。
このプロトコルは、体重20〜25グラムの8週齢の雄マウスで左尿管結紮を介して一方的な尿道閉塞マウスモデルを作成するために使用された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。腎臓は手術後8日間で採取された。
マイクロRNA qRT-PCRデータは、マイクロRNA 3070-3pのレベルが有意に増加し、マイクロRNAのレベル、7218-5pおよびマイクロRNA 7219-5pがコントロールと比較してUUOマウスの腎臓で減少したことを示した。このプロトコルを試みるとき、腎臓サンプルがフェニル/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、腎臓サンプルを繰り返して、良好なRNA抽出を達成することを忘れないでください。
