このqRT-PCR法は、加齢性腎障害などの状態のマウスの血清中のマイクロRNA発現プロファイリングに関連する質問に対処することができます。この技術は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスによって、高精度かつ高感度でマイクロRNA発現の検出を可能にします。はじめに、ピンセットと外科用ハサミを使用して腹部の皮膚を切開します。
腹膜の筋肉を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。
PBSで湿らせた綿棒2本を使用して、下大静脈を特定します。1ミリリットルの注射器に取り付けられた30Gの針を下大静脈に挿入し、注射器を引きます。溶血を避けるためにゆっくりと針を引き抜きます。
血液をヘパリンを含む1ミリリットルのスピッツチューブに移し、反転させて混合します。スピッツチューブを室温で3000倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
200マイクロリットルの血清サンプルを取り、1, 000マイクロリットルのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15回反転させて混合する。
サンプルを室温で3分間インキュベートし、続いて遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。450マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。
次に、700マイクロリットルのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムにロードし、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、キットに含まれている700マイクロリットルの洗浄バッファー1を追加します。再度遠心分離し、フロースルーを廃棄する。
500マイクロリットルの洗浄バッファー2で洗浄を繰り返し、微量の塩分を除去します。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、遠心分離機で、収集チューブからのフロースルーを廃棄します。スピンカラムを再度遠心分離し、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。
次に、14マイクロリットルのRNaseフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。カラムを室温で15000倍Gで1分間再度スピンさせる。マスターミックス溶液を調製し、8ウェルストリップチューブにウェルあたり8マイクロリットルを追加します。
抽出したトータルRNAを各チューブに12マイクロリットル加え、室温で2000倍Gで15秒間チューブを遠心分離する。チューブをサーマルサイクラーに入れ、インキュベーションを開始してcDNAを合成します。インキュベーション後、cDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移します。
cDNAを蒸留水で10倍に希釈します。その後ボルテックス、室温で2000倍Gで5秒間遠心分離を行った。マイクロ遠心チューブ内で、テキストプロトコルに記載されているようにマスターミックス溶液を調製し、溶液をボルテックスします。
96ウェルプレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのアリコートを加え、続いて2.5マイクロリットルのcDNAを加えます。粘着フィルムを使用してプレートを密封し、プレートを1000回G.で30秒間遠心分離します プレートをリアルタイムPCRシステムに入れます。実験の名前を指定して設定を変更します。
次に、実験タイプとして96ウェル0.2ミリリットル、定量方法として比較CT、システム実行モードとして標準、およびターゲット配列を検出するための試薬としてSYBR Green試薬を選択します。各ウェルのサンプルとターゲット miRNA の名前を指定します。重複サンプルを割り当て、参照サンプルと内在性コントロールを選択し、パッシブリファレンスとして使用する色素にはなしを選択します。
試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。次に、反応量を20マイクロリットルに設定し、PCRサイクル条件を摂氏95度で15分間設定し、次に摂氏94度で15秒間40サイクル変性し、摂氏55度で30秒間アニーリングし、摂氏70度で30秒間伸長します。プロセスが完了したら、分析をクリックしてqRT-PCRデータを分析します。
プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。
加齢腎障害モデルのmiRNA qRT-PCRデータは、SAMR1対照マウスと比較して、SAMP1実験マウスではmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが低下したことを示しました。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの株においても変化しなかった。miRNA-7219-5pおよびmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルはSAMP1マウスで有意に増加したが、miRNA-223-3pのレベルは変化しなかった。
下大静脈に針を挿入し、血管を貫通せずに血液を抽出する必要があります。この方法は、幅広い病的状態に対するマウス血清中のマイクロRNA発現プロファイリングにおける重要な質問に答えるために使用できます。
