多くの妊娠は、受精後7、8回のヒト胚発生の早い段階で失敗する。このプロトコルは、この神秘的な埋め込みウィンドウの間にインビトロで人間の概念を成長させる機会を研究者に提供します。これにより、ヒト移植と早期胎盤形成の成功を支えるメカニズムを理解することができます。
拡張培養システムを使用して、体外でヒト胚のペリ移植段階を成長させることは、おそらく移植および早期の栄養芽細胞分化を研究するための本物の材料を得る唯一の方法である。この簡単なテクニックは、人間の初期の開発に関する多くの基本的な質問に答えるための強力なツールです。このプロトコルを用いて行われた研究は、妊娠初期の喪失、再発性移植不全および胎盤病理の理解に大きく寄与する。
手順を実証することは、研究室の博士課程の学生、ディアドレ・ログドンです。胚の温暖化の1日前に、無菌層流れフードに培地と回収プレートを用意する。2つのセンターウェル臓器培養は、10%SPSでBMの500マイクロリットルで皿を洗い、その後、胚培養グレードオイルの500マイクロリットルでBMをカバーします。
16ミリメートルの組織培養皿では、胚培養油の層8ミリリットルおよび下部に10%SPSを有するBMの20マイクロリットル滴を固定する。洗浄皿と回収プレートを摂氏37度、二酸化炭素6%、酸素5%以上で少なくとも4時間平衡化します。アリコート IVC 1 の約 4 ミリリットルを 5 ミリリットルのスナップ キャップ チューブにし、オイル オーバーレイなしで IVC 1 の 500 マイクロリットルで 1 つの洗浄皿を準備します。
インキュベーター内の皿とチューブを少なくとも4時間平衡化する。PBSのヒト血清から1ミリリットル当たり30マイクログラムにフィブロネクチンを希釈する。ウェルに触れないように注意して8つのウェルチャンバーカバースリップパッケージを開き、フィブロネクチンの250マイクロリットルを各ウェルにそっとピペットします。
カバースリップの蓋を交換し、20〜24時間摂氏4度でインキュベートします。胚の温暖化の朝に拡張培養プレートを準備します。フィブロネクチンでチャンバーカバースリップを取り出し、層流フードに入れます。
その後、フィブロネクチン混合物を1ミリリットルのピペットで取り除き、廃棄します。平衡化されたIVC 1のピペット300マイクロリットルを各ウェルに入れ、透明帯を除去するまでカバースリップをインキュベーターに入れる。D5ヒト胚の温暖化と回収後、再拡張を評価し、各胚の写真を撮る。
各胚を5%FCSのMOPS緩衝処理媒体の500マイクロリットルに移動します。その後、テキスト原稿に記載されているように酸性タイローデの溶液でそれを扱います。溶解したゾナを含む胚を300マイクロリットルの温められたMOPS緩衝媒体にすぐに移し、タイロードの溶液を急がれる。
次に、胚を胚培養グレードオイルの下で10%SPSで平衡化されたBMを含む中央ウェル臓器組織皿に移動させる。その後、胚を20マイクロリットルの回収低下に戻す。個別に平衡IVC 1培地で洗浄皿に胚を移動し、各胚をチャンバーカバースリップの井戸に慎重に移動させ、胚の識別を追跡することを確認する。
チャンバーカバースリップを摂氏37度、二酸化炭素6%、大気中の酸素に2日間設定したインキュベーターに戻します。2日目に、顕微鏡下で胚の付着を注意深く調べ、培地を交換する。プレートを軽くタップして、どの胚が皿に取り付けられているかを知ります。
媒体を変えるために、蓋を取り外し、IVC1の150マイクロリットルを注意深く吸い込み、付属の胚を乱さないように注意する。胚がまだプレートに付着していない場合は、IVC 1の血清が付着に役立つため、培地を交換しないでください。平衡化された拡張培養培地の150マイクロリットルをゆっくりとピペットし、IVC2を各ウェルに入れ、カバースリップの蓋を交換する。
チャンバーカバースリップをインキュベーターに慎重に戻した。胚が固定または単一細胞消化の準備が整うまで、毎日メディア交換と添付ファイルチェックを繰り返します。使用済み培地の収集がさらに分析する必要がある場合は、取り出したIVC1の150マイクロリットルを無菌低結合0.5ミリリットルチューブにスナップ凍結します。
各胚を200マイクロリットルのPBSで1回洗い、各井戸に200マイクロリットルのトリプシン溶液を加えます。チャンバーカバースリップをインキュベーターに5分間戻します。小さなピペットまたは細かく引っ張られた口のピペットを使用して個々のMTBを拾い、より大きなピペットを使用して上下に吸引することによって胚を穏やかに解負します。
トリプシンで胚を合計10分間インキュベートするまで、小径のピペットチップを使用して、胚を穏やかに繰り返し吸引し続けます。単一細胞選択を行うために、解離した細胞をPBSの320マイクロリットル洗浄滴と胚培養油の下で0.1%PVPを介して移動し、細胞を失わないように注意する。細胞を洗浄した後、細かく引っ張られたガラスピペットを使用して1つのセルを選択します。
PBSとPVPの最小量で滅菌0.2ミリリットル低結合チューブに慎重に単一の細胞をピペット。液体窒素に自由な単一の細胞をスナップし、さらに使用するためにマイナス80°Cで保存します。健康な胚は、拡張培養の過程で増殖を続け、異常な胚は外縁から後退し、崩壊し始めた。
受精後の8日目には、胚のほとんどの細胞が細胞栄養芽細胞またはCTBであり、それは栄養芽細胞マーカーGATA-3に陽性であった。胚の周辺では、CTBはすでに多核のシンクジトロフォ芽細胞に分化しており、外観のようなシートを持ち、ヒトCGBに陽性に染色された。10日目において、CGB陽性回遊性栄養芽細胞の形成は最大であったが、これはこの時点でのHCG産生の盛り上がりによって確認された。
HLA-Gに陽性に染色された回遊性栄養芽細胞も出現し、胚の体内から離れて移動し始めた。12日目までに、STB分化は減少し、MTB産生はより顕著になり、10日目のホルモン産生から12日目の細胞遊泳への重点のシフトを示唆した。これらの変化は、移植期のタイムラプスビデオで観察することができる。
ビデオは、ブラストセレの崩壊、STBの形成、およびMTBの最終的な分化と移行を示しています。この手順を完了する際に留意する最も重要なことは、温度、浸透性およびpHの変化に敏感な生きた胚を扱っていることです。食器がインキュベーターから出ている時間を最小限に抑えることは、胚の健康を維持するために重要です。
この手順を完了した後、研究者は、ヒト移植および早期胎盤形成中のエピジェネティックおよび転写学的変化をよりよく理解するために、単一細胞RNAシーケンシングや全ゲノムバイサルファイトシーケンシングなどの下流の単一細胞オミクスアッセイに単離された単一細胞を使用することができる。
