Este trabalho foi viabilizado através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado vitoriano e do Governo Australiano NHMRC IRIISS e apoiado por financiamento do National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) e do Australian Research Council (KJH #FT190100265). Os autores gostariam de reconhecer o apoio técnico da Plataforma monash de pesquisa animal, da Plataforma de Histologia Monash e da instalação Monash Micro Imaging.

Os ovários foram coletados de camundongos C57BL6J femininos. Todos os procedimentos e experimentos em animais foram realizados de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Uso de Animais e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Plataforma de Pesquisa Animal de Monash.
NOTA: Um agente quimioterápico mostrou esgotar oócitos folículos primordiais, conforme determinado por meio da estereologia11 e conta 12diretas12,13 foi utilizado neste relatório para comparar os dois métodos de contagem no mesmo animal. Camundongos do sexo feminino, de 8 semanas de idade (adulto jovem) foram pesados antes de uma única injeção intraperitoneal de 75 mg/kg/peso corporal de ciclofosfamatida, ou controle de veículo salino (n=5/grupo). Esta dose tem sido demonstrada como causando um esgotamento aproximado de 50% dos folículos primordiais, mas não relatada para causar morbidade ou mortalidade em camundongos14. Os ovários foram colhidos 48 horas após o tratamento. Um ovário de cada animal foi fixado em 10% (v/v) solução de formalina tamponada neutra por 24 horas, e o outro fixado na solução de Bouin por 24 horas. O tecido foi então incorporado em resina glicolmethacrilato e seção serial em 20 μm, ou em parafina e seção serial em 5 μm. Todos os tecidos estavam manchados com ácido periódico Schiff e hematoxilina.
1. Preparação histológica: fixação, processamento, incorporação e secção de ovários de rato
<ol><li>Dissecar os ovários do rato aparando o oviduto e toda a gordura circundante, sem danificar ou cortar o ovário em si. Se necessário, utilize um microscópio de dissecação e lâmina fina para esta etapa(Figura 1A).</li>
	<li>Fixar os tecidos imediatamente colocando em um pequeno tubo rotulado contendo fixação (estereologia) de Bouin ou fixação formalina (contagens diretas) por 24 horas(Figura 1B),antes de transferir tecidos para 70% de etanol. NOTA: A morfologia folículo é melhor conservada dentro do tecido ovariano fixo de Bouin, embutido na resina glicolmetatocrila(Figura 2).</li>
	<li>Processe ovários fixos inteiros e, em seguida, incorpore resina glicolmethacrilato para estereologia(Arquivo Suplementar 1), ou cera de parafina para contagens diretas usando um protocolo histológico padrão. ATENÇÃO: A resina é tóxica, por isso certifique-se de que todas as etapas de processamento de tecidos sejam realizadas em um capô de fumaça e as luvas sejam usadas o tempo todo.</li>
	<li>Use um microtome de resina especializada(Figura 1C)equipado com uma faca de vidro (Figura 1D) para cortar exaustivamente seções de resina glicolmetatocrilato grossa (por exemplo, 20 μm). Colete as seções em um intervalo regular (por exemplo, cadaseção 3) em slides de microscópio de vidro para estereologia.</li>
	<li>Use um microtome padrão para cortar seções finas de parafina (por exemplo, 4-6 μm). Colete seções de tecido em um intervalo regular (por exemplo, a cada 9seção) em um slide de microscópio de vidro para contagem direta de folículos.</li>
	<li>Colorisse os slides com ácido periódico Schiff e hematomatoxilina(Arquivo Suplementar 2).</li>
	<li>Tampar com DPX padrão para seções de parafina, ou DPX espesso para seções de resina glicolmethacrila(Figura 1E). ATENÇÃO: Resina de glicolmetatocrila A DPX é perigosa, por isso realize esta etapa no capô da fumaça. NOTA: Resina glicolmetatocrila DPX é extremamente viscoso. A mancha de vidro deve ser aderida firmemente pressionando-a para baixo com uma espátula para garantir que o DPX esteja uniforme e finamente disperso, e não há bolhas de ar presentes sob o deslizamento de cobertura(Figura 1F).</li>
</ol>2. Estimativa esterológica do número do folículo primordial usando o fracionado óptico
<ol><li>Ligue o computador, a unidade de multicontrole, a câmera e a fonte de luz dentro da configuração de estereologia e defina o objetivo do microscópio para uma baixa ampliação (por exemplo, 10x).</li>
	<li>Abra o software de estereologia.</li>
	<li>Coloque o primeiro slide com segurança no estágio do microscópio.</li>
	<li>Ajuste a exposição à luz verificando-se automaticamente em exposição no painel Configurações da câmera (Figura Suplementar 1A). Alternativamente, ajuste manualmente a exposição à luz.</li>
	<li>Use o joystick para localizar a primeira amostra de tecido e colocar a amostra em foco.</li>
	<li>Ajuste o balanço de branco, clicando em Mais Configurações (localizado no canto inferior direito do painel Configurações da câmera) e clique em Balanço de Branco e clique em Automático ( FiguraSuplementar 1B). Como alternativa, clique no botão Balanço branco adjacente ao botão Mais Configurações (ou Selecione Área em Mais Configurações),para definir o balanço de branco manualmente selecionando uma área branca na seção.</li>
	<li>Vá para o menu de soltar sondas e clique em Optical Fractionator Workflow. Em seguida, clique em Iniciar novo projeto e clique em OK.
	<ol>
<li>Se uma configuração de amostragem existente tiver sido salva, sob parâmetros de amostragem clique em Sim | ...eu não vou. e selecione a configuração de amostragem desejada.</li>
		<li>Caso não, clique em Não e digite manualmente as informações da seção serial(Figura Suplementar 1C) e defina a configuração do teste na etapa 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Clique em Next, defina o microscópio como Baixa Ampliação e escolha a ampliação de 10x no menu suspenso.</li>
	<li>Clique em Nexte, em seguida, trace toda a seção ovariana - comece pela esquerda clicando ao redor da seção e no final, clique com o botão direito do mouse e escolha Contorno Próximo.</li>
	<li>Clique em Next, defina o microscópio para Alta Ampliação e escolha a ampliação de óleo 100x no menu suspenso.</li>
	<li>Coloque uma gota de óleo na seção de tecido na lâmina e mova o objetivo do microscópio para a ampliação de 100x.</li>
	<li>Ajuste a exposição à luz (como na etapa 2.4) e clique em Next.</li>
	<li>Configure os Parâmetros de Amostragem para definir a configuração da sonda. Aqui, o quadro de contagem foi definido para 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2) e o comprimento da etapa foi definido para 100 μm x 100 μm (10.000 μm2)(Figura Suplementar 2). Uma vez estabelecidos os parâmetros de amostragem, salve o modelo e reassente novamente durante as sessões de análise subsequentes na etapa 2.7.</li>
	<li>Clique em Iniciar a Contagem (Figura Suplementar 1D). Concentre-se no topo da amostra, clique em OK e comece a contar.</li>
	<li>Use o botão de focalamento para mover-se através da profundidade amostral de 10 μm e contar quaisquer folículos primordiais cujo núcleo oócito entra em foco. Clique em Seguir para passar para a próxima área.<ol>
<li>Classificar folículos como primordial se o oócito estiver cercado por células escânneas (achatadas) de granulosa, mas sem células de granulosa cuboidal(Figura 2A). NOTA: Os folículos primordiais são distintos dos folículos intermediários/transitórios, que compreendem uma combinação de células de granulosa cuboidal e escamosa(Figura 2B),e folículos primários, que são cercados predominantemente por células de granulosa cuboidal(Figura 2C). Estas classes folículos devem ser quantificadas separadamente.</li>
		<li>Só contam folículos em que o núcleo oócito é visível. O núcleo oócito deve aparecer dentro do quadro de contagem ou estar tocando as linhas de inclusão verde do quadro de contagem (Figura Suplementar 1E,F).</li>
		<li>Se o núcleo oócito ficar fora do quadro de contagem(Figura Suplementar 1G) ou tocar nas linhas vermelhas de exclusão do quadro de contagem, não conte este folículo.</li>
		<li>Ao avaliar o esgotamento do folículo primordial em resposta a um produto químico exógeno (por exemplo, quimioterapia), certifique-se de que todos os folículos contados sejam saudáveis e, portanto, tenham morfologia normal(Figura 2). Conte todos os folículos anormais ou atreóticos separadamente. Muitas vezes, a morte folículo é induzida por insultos como a quimioterapia, e a quantificação dos folículos atreticos deve ser obtida separadamente, a fim de distinguir entre folículos saudáveis e atrápticos, pois apenas folículos saudáveis compõem a reserva ovariana15.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que a contagem esteja completa nessa seção, faça um dos seguintes:<ol>
<li>Clique em Adicionar nova seçãoe, em seguida, retorne ao passo 2.3 para configurar a próxima seção para contar.</li>
		<li>Clique em I've Finished Counting para terminar a sessão. Retorne o objetivo para 10x, saia do software de estereologia e desligue a fonte de luz, câmera, unidade multicontrole e computador.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtenha a soma do número do folículo bruto (Q) de cada seção de tecido amostrada de todo o ovário, em seguida, usando uma planilha, use a equação abaixo para obter o valor final de cada animal de réplica (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">onde: N = Número total estimado de folículos dentro do ovário. Q = Contagem de folículos primordiais brutos. f1 = Intervalo amostral. A cada 3ª seção foi amostrada assim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> . f2 = Relação entre o quadro de contagem (área de amostra) e o stepper, calculado como <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . Uma vez que a área amostral foi de 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) e a área do passo foi de 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . f3 = Fração de seção ovariana amostrada. Desde que 10 μm da seção de 20 μm foi amostrada, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . Portanto, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . NOTA: Este protocolo descreve como aplicar esses princípios de análises esterológicas utilizando um software de estereologia amplamente citado (Tabela de Materiais); no entanto, outros softwares esterológicos estão disponíveis. Os princípios aplicados durante as análises eseléológicas dos folículos ovarianos são os mesmos, independentemente do software utilizado para configurar os parâmetros. A estereologia é mais precisa quando 100 ou mais objetos são contados em um ovário de rato adulto4, pois isso dá um coeficiente de erro para a estimativa abaixo de 10%16. Os parâmetros amostrais aqui descritos foram otimizados para garantir que um mínimo de aproximadamente 100 objetos (ou seja, folículos primordiais, transitórios e primários) possam ser contados no controle de ovários C57BL6J adultos. Um estudo piloto pode ser realizado incluindo um pequeno tamanho amostral para estabelecer os parâmetros amostrais ideais, como o intervalo e o número de seções a serem analisadas e o número de dissetores ópticos dentro das seções amostradas17.</li>
</ol>3. Estimativa do número do folículo primordial por contagem direta de folículo ovariano
<ol><li>Coloque o slide do microscópio com segurança sob um microscópio de luz padrão e execute contagens diretas para obter o número do folículo primordial bruto.<ol>
<li>Classificar folículos como primordial se o oócito for claramente visível e estiver cercado por células de granulosa escânparadas (achatadas), mas sem células de granulosa cuboidal(Figura 2D). NOTA: Os folículos primordiais são distintos dos folículos intermediários/transitórios, que compreendem uma combinação de células de granulosa cuboidal e es es escânnea(Figura 2E),e folículos primários, que são cercados predominantemente por células de granulosa cuboidal(Figura 2F). Estas classes folículos devem ser quantificadas separadamente.</li>
		<li>Certifique-se de que todos os folículos contados são saudáveis e, portanto, têm morfologia normal(Figura 2). Conte todos os folículos anormais ou atreóticos separadamente, pois apenas folículos saudáveis compõem a reserva ovariana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, tome fotomicógrafos múltiplos ou costurados de alta potência (por exemplo, 20x) de toda a seção de tecido ovariano para executar a contagem, abrindo os arquivos de imagem(s). Isso pode ser feito manualmente ou usando um scanner de slides automatizado.</li>
	<li>Obtenha a soma do número do folículo bruto (Q) de cada seção de tecido amostrada de todo o ovário no intervalo predeterminado. Multiplique este número pelo inverso da fração amostral para obter o valor final para cada animal de réplica (N), utilizando a equação abaixo. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">onde: N = Número total estimado de folículos dentro do ovário. Q = Contagem de folículos brutos (de cada tipo individual, calculado separadamente). f1 = Intervalo amostral. Todas as 9seções foram amostradas <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> assim. Portanto, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. 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S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo para a técnica padrão-ouro para enumerar folículos primordiais do rato, estereologia e o método mais comumente empregado de contagem direta de folículos. O tratamento quimioterápico foi utilizado para comparar e contrastar os resultados obtidos a partir desses dois métodos diferentes dentro do ovário esquerdo e direito do mesmo animal. Ambos os métodos revelaram alta variabilidade inter-animal em números de folículos primordiais. Um esgotamento significativo da re...

Os oócitos imaturos e meioticamente presos armazenados dentro de folículos primordiais no ovário são a unidade de armazenamento da germe feminina e compõem a reserva ovariana vitalícia de um indivíduo. Os números de folículos primordiais diminuem naturalmente com a idade1, ou alternativamente, podem ser prematuramente esgotados após a exposição a produtos químicos exógenos, incluindo alguns fármacos e tóxicos ambientais no ar, alimentos e água2. Dado que o número primordial do folículo é finito, a quantidade e a qualidade dos folículos presentes dentro do ovário determinam em grande parte a fertilidade feminina e a saúde dos filhos. Assim, a quantificação precisa do número de folículos primordiais nas mulheres é essencial para avaliar os impactos fora do alvo de insultos exógenos na reserva ovariana.
Nas mulheres, a análise de todo o ovário geralmente não é possível, portanto, medidas não invasivas de substituto da reserva ovariana devem ser utilizadas em um ambiente clínico. O hormônio anti-Mϋllerian (AMH) é o biomarcador substituto mais utilizado clinicamente3. Os níveis de AMH do soro são frequentemente medidos em mulheres com idade materna avançada, ou antes e depois do tratamento do câncer, como a quimioterapia. No entanto, a AMH é produzida por folículos crescentes e não por folículos primordiais, e, portanto, os níveis de soro não informam sobre o número absoluto de folículos primordiais.
Com a ausência de métodos para determinar com precisão o número de folículos primordiais em mulheres in situ, contar folículos ovarianos em pequenos modelos animais, como roedores, continua sendo uma ferramenta de pesquisa essencial para avaliar o grau pelo qual insultos exógenos impactam nos folículos primordiais e, portanto, na fertilidade. Infelizmente, porém, os relatos ao longo da literatura de números de folículos primordiais em modelos de roedores são altamentevariáveis 4. Uma das principais razões para isso são as diferenças técnicas amplamente relatadas no método de contagem empregado. Predominantemente, existem duas técnicas diferentes descritas na literatura para enumerar folículos primordiais em camundongos. Estes incluem estereologia, que emprega o método de dissetor óptico fracionado, e contagem direta de folículos.
A estereologia é amplamente considerada o padrão-ouro, pois utiliza amostragem aleatória uniforme sistemática5, tornando-se o método mais preciso de quantificar o número de folículo primordial em todo o rato, ou ovários de ratos4,6,7. A estereologia é imparcial, pois explica a estrutura tridimensional do objeto de interesse8. Utilizando um método de dissetor/fracionado óptico, três níveis de amostragem são aplicados para quantificar folículos primordiais usando seções de tecido grosso (por exemplo, 20 μm) dentro de uma fração conhecida do ovário total do rato. Em primeiro lugar, o intervalo amostral é escolhido (por exemplo, cada 3seção) em um início aleatório (fração amostral 1, f1)4. As seções são então amostradas de forma sistemática e uniforme a partir deste ponto através de todo o ovário. Em seguida, um quadro de contagem imparcial é sobreposto sobre a seção ovariana e movido progressivamente ao longo de uma grade de contagem definida e aleatória (fração amostral 2, f2)8. Por fim, uma fração conhecida da espessura da seção é amostrada opticamente (por exemplo, 10 μm) e folículos dentro desta área são contados (fração amostral 3, f3)4. O número do folículo bruto é multiplicado pelo inverso dessas frações amostrais para obter o valor final. Este método requer treinamento especializado e equipamentos, incluindo um microscópio com um estágio motorizado conduzido por software stereológico. Os tecidos devem ser preservados em um fixador especializado de Bouin, e embutidos na resina glicolmetatocrila para permitir que seções de tecido grosso sejam cortadas usando um microtome de resina glicolmetatocrila com uma faca de vidro. Este método é projetado para explicar o encolhimento e deformação tecidual, para preservar melhor a estrutura morfológica tridimensional do ovário e dos folículos9.
A contagem direta de folículos é o método mais utilizado para contar folículos10. Fixativos mais comuns (ou seja, formalina) podem ser usados, seguidos de incorporação de cera de parafina e seção serial exaustiva usando um microtome padrão com uma espessura entre 4-6 μm. Os folículos são sistematicamente contados em toda a seção tecidual em um intervalo definido e multiplicados pelo inverso do intervalo amostral para obter a estimativa total do folículo. Este método é rápido, fácil, pode ser realizado usando tecidos arquivados, e preparado usando técnicas histológicas padrão. Requer apenas um microscópio leve com recursos de imagem padrão. No entanto, apesar dessas vantagens, a contagem direta de folículos carece da precisão e dos rigorosos parâmetros de contagem de estereologia, tornando-o mais propenso ao viés do investigador. Além disso, os tecidos podem sofrer encolhimento e deformação durante o processamento, interrompendo a integridade e a morfologia do ovário e dificultando a classificação e quantificação do folículo.
O objetivo deste artigo é descrever dois métodos comumente utilizados para avaliar quantitativamente o número de folículos primordiais nos ovários do rato: estereologia e contagem direta de folículos. Forneceremos protocolos detalhados para esses dois métodos e destacaremos alguns de seus pontos fortes e fracos, a fim de melhorar a reprodutibilidade em nosso campo e permitir que os pesquisadores tossem uma decisão informada do método de contagem mais adequado para seus estudos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Mamíferos fêmeas sexualmente reprodutos nascem com todo o seu suprimento de oócitos. Oócitos imaturos e quiescentes são encontrados dentro de folículos primordiais, a unidade de armazenamento da germina feminina. Eles não são renováveis, assim seu número ao nascer e a taxa subsequente de perda dita em grande parte a vida fértil feminina. A quantificação precisa dos números de folículos primordiais em mulheres e animais é essencial para determinar o impacto de medicamentos e toxicantes na reserva ovariana. Também é necessário avaliar a necessidade e o sucesso das técnicas de preservação da fertilidade existentes e emergentes. Atualmente, não existem métodos para medir com precisão o número de folículos primordiais que compõem a reserva ovariana em mulheres. Além disso, a obtenção de tecido ovariano de animais grandes ou espécies ameaçadas para experimentação muitas vezes não é viável. Assim, os camundongos tornaram-se um modelo essencial para tais estudos, e a capacidade de avaliar números de folículos primordiais em ovários inteiros de camundongos é uma ferramenta crítica. No entanto, os relatos de números absolutos de folículos em ovários de camundongos na literatura são altamente variáveis, dificultando a comparação e/ou replicação de dados. Isso se deve a uma série de fatores, incluindo tensão, idade, grupos de tratamento, bem como diferenças técnicas nos métodos de contagem empregados. Neste artigo, fornecemos um guia instrutivo passo a passo para preparar seções histológicas e contar folículos primordiais em ovários de camundongos usando dois métodos diferentes: [1] estereologia, que conta com a técnica de dissetor fracionado/óptico; e [2] a técnica de contagem direta. Algumas das principais vantagens e desvantagens de cada método serão destacadas para que a reprodutibilidade possa ser melhorada no campo e para permitir que os pesquisadores selecionem o método mais adequado para seus estudos.

Utilizou-se um modelo bem caracterizado de esgotamento folículo, pelo qual foram administrados camundongos adultos jovens de uma única dose de quimioterapia ciclofosfamida, ou controle de veículo salino (n=5/grupo) e ambos os ovários foram colhidos de cada animal após 48 horas. Um ovário por animal foi preparado como descrito no Passo 1 para cada um dos dois métodos: estereologia ou contagem direta. O ovário esquerdo e direito de cada animal foi aleatoriamente atribuído a cada grupo. Esses dados mostram que, ao ...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K visualizações.  Monash University. Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Biologia do Desenvolvimento

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, the ability to determine an embryo&#39;s sex is necessary in many experiments particularly regarding early development. The present protocol demonstrates an inexpensive, rapid and non-toxic preparation of pig genomic DNA for use with PCR. Day 30 embryos must be humanely collected according to the guidelines established by Institutional Animal Policy and Welfare Committees for the present protocol. The preparation of the whole embryo for this PCR based sexing technique simply involves grinding the frozen embryo to a fine powder using a pre-chilled mortar and pestle. PCR-quality DNA is released from a small amount of embryo powder by applying a hot incubation in an alkaline lysis reagent. Next, the DNA solution is mixed with neutralization buffer and used directly for PCR. Two primer pairs are generated to detect specific sex determining region of the Y- chromosome (SRY) and ZFX region of the X- chromosome with high accuracy and specificity. The same protocol can be applied to other elongated embryos (Day 10 to Day 14) earlier than Day 30. Also, this protocol can be carried with 96-welled plates when screening a large number of embryos, making it feasible for automation and high-throughput sex typing.

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...