この方法は、眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを実証し、導入遺伝子発現とタンパク質分泌の証拠となります。眠れる森の美女トランスポゾンシステムとエレクトロポレーションの組み合わせにより、初代ヒト色素上皮細胞の効率的なトランスフェクション、ならびに安定した持続的な導入遺伝子発現およびタンパク質分泌が可能になります。全体的な目的は、治療活性タンパク質の安定的かつ持続的な分泌を必要とする網膜変性疾患の治療のための細胞ベースの遺伝子付加療法を確立することです。
手順を実演するのは、研究所の医療技術助手であるアン・フライアルデンホーフェンとアンティエ・シーファーです。初代ヒトRPE細胞エレクトロポレーション用のプラスミドDNAを調製するには、マイクロボリューム分光光度計を使用してプラスミドDNA含有量を定量し、10ミリモルのTris-HCLの濃度をマイクロリットルあたり250ナノグラムに調整します。SB100XトランスポザーゼプラスミドDNAの1マイクロリットルあたり250ナノグラムの1容量と、色素上皮由来因子トランスポゾンプラスミドDNAのマイクロリットルあたり250ナノグラムの16容量を混合します。
得られた血漿混合物2マイクロリットルを氷上の滅菌1.5ミリリットルのセーフロックマイクロ遠心チューブに加え、バッファーチューブに3ミリリットルのバッファーを充填します 次に、カチッという音がするまでチューブをピペットステーションに挿入し、トランスフェクションデバイスを1, 100ボルト、20ミリ秒のパルス幅、および2つのパルスに設定します。エレクトロポレーションのために細胞を調製する。まず、位相差顕微鏡で初代RPE細胞培養の形態を確認し、増殖とコンフルエント性を評価します。
細胞培養インキュベーター内で、ウェルあたり500マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を7〜15分間処理します。細胞が剥離したら遠心分離により細胞を回収し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、トランスフェクション反応あたり10〜4個の細胞アリコートを1〜10回遠心分離する。ペレットをチューブあたり11マイクロリットルのバッファーRに再懸濁し、調製したプラスミド混合物を2マイクロリットルずつ各チューブに加えます。
トランスフェクションピペットのヘッドを10マイクロリットルのトランスフェクションチップに挿入し、クランプがピストンの取り付けステムを完全にピックアップし、細胞とプラスミド溶液をトランスフェクションチップにロードします。トランスフェクションピペットをピペットステーション内のバッファーチューブにカチッという音がするまで挿入し、startを押してエレクトロポレーションプロセスを開始します。トランスフェクション後、トランスフェクションピペットをピペットステーションから慎重に取り出し、直ちに細胞とプラスミド溶液を細胞培養プレートの調製ウェルにピペットで入れます。
RPE細胞培養上清からhisタグ付き色素上皮由来因子融合タンパク質を精製した。まず、ベベルカットチップを使用して、サンプルあたり30マイクロリットルのニッケルNTAスラリーを1個集め、遠心分離によってニッケルNTA樹脂をペレット化します。ニッケルNTA樹脂を200マイクロリットルのOne Xインキュベーションバッファーで慎重に再懸濁し、追加の遠心分離で溶液を2回ペレット化します。
2回目の遠心分離後、ニッケルNTA樹脂ペレットをサンプルあたり40マイクロリットルのFour Xインキュベーションバッファーで注意深く再懸濁します。次に、55マイクロリットルの前処理ニッケルNTAスラリーを260マイクロリットルのFour Xインキュベーションバッファーおよび900マイクロリットルの各トランスフェクトRPE細胞培養上清と混合します。混合物を室温のロッキングシェーカーで60分間インキュベートし、ニッケルNTA樹脂混合物を再びペレット化します。
ペレットを175マイクロリットルのOne Xインキュベーションバッファーに注意深く再懸濁し、混合物をさらに2回遠心分離します。2回目の遠心分離後、ニッケルNTA樹脂ペレットを30マイクロリットルの溶出バッファーに注意深く再懸濁し、振とうしながら室温で20分間インキュベートし、サンプルを再度遠心分離します。次に、上清を注意深く収集し、精製タンパク質の西部血液分析のために2つのX SDSサンプルバッファーと混合します。
ヒトドナーの目から単離された培養初代RPE細胞は、ドナーの年齢、死後の分離時間、または培養時間に関係なく、典型的な石畳の形態を示します。初代ヒトRPE細胞への短期間の電気パルスの適用。キャピラリートランスフェクションシステムを使用しても、上皮形態に悪影響はありません。
トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞培養上清のウェスタン血液分析では、500日以上導入遺伝子サイレンシングなしで一貫したレベルで色素上皮由来因子分泌が示されています。連続的に実施されたトランスフェクションからの細胞培養培地のこの代表的な西洋血液分析で観察されるように、トランスフェクション後21日目に普遍的に高い色素上皮由来因子分泌率が観察されます。追求された培養では、長期的なPEDF分泌の上昇は少なくとも165日間続きます。
さらに、ELISAベースの定量により、トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞における総色素上皮由来因子分泌が、それぞれの非トランスフェクト対照細胞と比較して20倍増加することが明らかになりました。この増加は、総PEDF発現が30倍以上に上昇した遺伝子発現レベルでも確認された。このプロトコルを試みる場合、形態がIn Vivo状態に対応する色素上皮細胞を使用することが重要です。
また、気泡のないトランスフェクションチップに細胞溶液を吸い込むことを忘れないでください。安定にトランスフェクトされた細胞は、この細胞ベースの遺伝子付加療法の機能を検証するために、異なるEx VivoまたはIn vivoモデルで使用することができます。
