Bu yöntem, transgen ekspresyonu ve protein sekresyonu için bir kanıt olan Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi kullanılarak birincil insan pigment epitel hücrelerinin elektroporasyon bazlı transfeksiyonunu göstermektedir. Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi ve elektroporasyonun kombinasyonu, birincil insan pigment epitel hücrelerinin etkili transfeksiyonunun yanı sıra stabil ve kalıcı transgen ekspresyonu ve protein sekresyonunu sağlar. Genel amaç, terapötik olarak aktif proteinin stabil ve kalıcı olarak salgılanmasını gerektiren retinal dejeneratif hastalıkların tedavisi için hücre bazlı bir gen ilavesi tedavisi oluşturmaktır.
Prosedürü gösterenler, laboratuvardan tıbbi teknik asistanlar olan Anne Freialdenhoven ve Antje Schiefer olacak. Plasmid DNA'sını birincil insan RPE hücresi elektroporasyonuna hazırlamak için, Plazmid DNA içeriğini ölçmek için bir mikro hacimli spektrofotometre kullanın ve konsantrasyonu 10 milimolar Tris-HCL'de mikrolitre başına 250 nanograma ayarlayın. SB100X transpozaz Plazmid DNA'sının mikrolitresi başına 250 nanogramlık bir hacmi, mikrolitre pigment epiteli kaynaklı faktör transpozon Plazmid DNA'sı başına 16 hacim 250 nanogram ile karıştırın.
Elde edilen plazma karışımının iki mikrolitresini buz üzerinde steril bir 1,5 mililitre güvenli kilit mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve bir tampon tüpünü üç mililitre tampon E. ile doldurun Daha sonra bir tıklama duyulana kadar tüpü pipet istasyonuna yerleştirin ve transfeksiyon cihazını 1.100 volta, 20 milisaniyelik bir darbe genişliğine ve iki darbeye ayarlayın. Hücreleri elektroporasyona hazırlamak. İlk olarak, büyümelerini ve akıcılıklarını değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu ile primer RPE hücre kültürlerinin morfolojisini kontrol edin.
Hücreleri, hücre kültürü inkübatöründe yedi ila 15 dakika boyunca kuyu başına 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin EDTA ile tedavi edin. Hücreler ayrıldığında, hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve transfeksiyon reaksiyonu başına dört hücre alikotuna bir ila 10 kez 10 santrifüj yapın. Peletleri tüp başına 11 mikrolitre tampon R içinde yeniden askıya alın ve hazırlanan plazmid karışımının iki mikrolitresini her tüpe ekleyin.
Bir transfeksiyon pipetinin kafasını, kelepçe pistonun montaj gövdesini tamamen alana ve hücre ve plazmid çözeltisini transfeksiyon ucuna yükleyene kadar 10 mikrolitrelik bir transfeksiyon ucuna yerleştirin. Transfeksiyon pipetini, bir tıklama duyulana kadar pipet istasyonu içine yerleştirilen tampon tüpüne yerleştirin ve elektroporasyon işlemine başlamak için başlat düğmesine basın. Transfeksiyondan sonra, transfeksiyon pipetini pipet istasyonundan dikkatlice çıkarın ve hemen hücre ve plazmid çözeltisini hücre kültürü plakasının hazırlanan kuyucuklarına pipetleyin.
Etiketli pigment epiteli kaynaklı faktör füzyon proteinlerini RPE hücre kültürü süpernatantlarından arındırmak için. İlk olarak, numune başına bir adet 30 mikrolitre nikel NTA bulamacı aliquot toplamak için bir konik kesim ucu kullanın ve nikel NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin. Nikel NTA reçinesini 200 mikrolitre One X inkübasyon tamponu ile dikkatlice askıya alın ve çözeltiyi iki kez ek bir santrifüjleme ile pelet edin.
İkinci santrifüjlemeden sonra, nikel NTA reçine peletlerini numune başına 40 mikrolitre Four X inkübasyon tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın. Daha sonra 55 mikrolitre bir aliquot ön işlemden geçirilmiş nikel NTA bulamacı, 260 mikrolitre Dört X inkübasyon tamponu ve her transefcted RPE hücre kültürü süpernatan 900 mikrolitre ile karıştırın. Karışımı 60 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin ve nikel NTA reçine karışımlarını tekrar pelet edin.
Peletleri 175 mikrolitre One X inkübasyon tamponunda dikkatlice askıya alın ve karışımları iki kez daha santrifüj edin. İkinci santrifüjlemeden sonra, nikel NTA reçine peletlerini 30 mikrolitre Elüsyon tamponunda oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için dikkatlice yeniden askıya alın ve numuneleri tekrar çalkalayın ve santrifüj yapın. Daha sonra süpernatantları dikkatlice toplayın ve saflaştırılmış proteinlerin batı kan analizi için İki X SDS numune tamponu ile karıştırın.
İnsan donör gözlerinden izole edilen ekili primer RPE hücreleri, donörün yaşına, ölüm sonrası izolasyon zamanına veya ekim zamanına bakılmaksızın tipik bir parke taşı morfolojisi göstermektedir. Kısa süreli elektrik darbelerinin birincil insan RPE hücrelerine uygulanması. Kılcal transfeksiyon sisteminin kullanılması epitel morfolojisini olumsuz yönde etkilemez.
Transfekte primer insan RPE hücre kültürü süpernatantlarının Batı kan analizi, 500 günden fazla bir süre boyunca transgen susturulmadan tutarlı seviyelerde pigment epitel kaynaklı faktör sekresyonunu göstermektedir. Seri olarak gerçekleştirilen transfeksiyonlardan hücre kültürü ortamının bu temsili Batı kan analizinde gözlemlendiği gibi, transfeksiyondan 21 gün sonra evrensel olarak daha yüksek pigment epitel kaynaklı faktör sekresyon hızı gözlenmektedir. Takip edilen bir kültürde, uzun süreli yüksek PEDF sekresyonu en az 165 gün sürer.
Ek olarak, ELISA bazlı niceleme, transfekte primer insan RPE hücrelerinde toplam pigment epitel kaynaklı faktör sekresyonunun, transfekte edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla 20 kat arttığını ortaya koymaktadır. Bu artış, toplam PEDF ekspresyonunun 30 kattan fazla yükseltildiği gen ekspresyon seviyesinde de doğrulandı. Bu protokolü denerken, morfolojisi In Vivo durumuna karşılık gelen pigment epitel hücrelerinin kullanılması önemlidir.
Ayrıca, hücre çözeltisini hava kabarcıkları olmadan transfeksiyon ucuna çekmeyi unutmayın. İstikrarlı transfekte hücreler, bu hücre bazlı gen ekleme tedavisinin işlevselliğini doğrulamak için farklı Ex Vivo veya In vivo modellerinde kullanılabilir.
