この方法は、卵母細胞成熟時に翻訳を制御する調節要素を識別し、特徴付けるために使用することができる。我々は、インビトロ卵母細胞成熟を通じてレポーターの蓄積を評価するためにタイムラプス顕微鏡を適用した。これは、卵母細胞の成熟中に翻訳活性化または抑圧が行われる時間を正確に特定します。
まず、26ゲージ針で卵胞壁に小さな切り傷を入れ、角包を慎重に開けます。口操作ガラスピペットを使用して、cumulus細胞のいくつかの層を持つ無傷のCOCを分離します。より小さなピペットを使用し、繰り返しピペット処理を行うことによってCOCを機械的に脱裸にします。
裸卵母細胞を吸引し、クロスターミドの1ミクロモルを補った成熟培地を含むシャーレに入れます。卵母細胞が卵胞からの分離によって引き起こされるストレスから回復できるように、皿を2時間保育器に入れます。長さ10センチメートルのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをメカニカルプーラーに入れ、注射針を準備します。
最適な注入のために熱されたフィラメントを使用して45度の角度で針先を曲げてください。ポリスチレン皿に基本的な卵母細胞採取培地の20マイクロリットルの液滴を入れ、軽いミネラルオイルで液滴を覆います。Ypet UTRとmCherryのマイクロリットル当たり12.5マイクログラムをそれぞれ追加して、より大きな量のレポーターミックスを準備します。
これらのアリコートをマイナス80度で保管してください。解凍すると、20,000倍Gで2分間アリコートを遠心分離し、新しいマイクロ遠心分離管に移します。注射針に約0.5マイクロリットルのレポーターミックスを積み込みます。
保持ピペットと注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に入れる。注入針を、保持ピペットにそっと叩いて開きます。卵母細胞を基本採取培地の液滴に入れ、レポーターミックスの5〜10ピコリターを注入する。
卵母細胞と成熟培地を1マイクロモルクロスターミドで16時間インキュベートし、mCherry信号を高原にします。タイムラプス顕微鏡の場合は、注入されたレポーターごとに20マイクロリットルの成熟培地のペトリ皿、制御プロフェーズI逮捕卵母細胞のための1つの小臼歯シロスターミドを含む1滴、および成熟卵細胞のためのクロスタミドなしの1滴を準備する。軽いミネラルオイルで液滴を覆い、インキュベーターに入れます。
インキュベーション後、注入した卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスターミドなしで成熟培地で4回洗浄します。一つのミクロモルシロスタミドを熟成I卵子対照群として成熟培地に入れる。注入された卵母細胞を、以前に調製したタイムラプス顕微鏡皿のそれぞれの液滴に移す。
閉じたガラスピペットで卵母細胞をクラスター化して、記録中の動きを防ぎます。テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、発光ダイオード除去システムと37°Cと5%の二酸化炭素で維持された環境室を装備した電動ステージを備えた顕微鏡の下に皿を置きます。[アプリ]をクリックし、[多次元取得]をクリックして、タイムラプス実験に適した設定を入力します。
最初のタブを選択して、タイムラプス、複数のステージ位置、および複数の波長を選択します。[保存]タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。次に、タブ Time-Lapse を選択して、時間ポイント数、期間、および時間間隔を入力します。
タブステージを選択し、明視野をオンにし、新しいウィンドウを開いて取得、取得、およびライブを表示を選択して、卵母細胞の位置を見つけます。卵母細胞が見つかったら、多次元取得ウィンドウに戻り、プラスを押して卵母細胞の位置を設定します。「波長」タブを選択し、明視野、YFP、および mCherry の 3 つの異なる波長を設定します。
Ypet と mCherry の露出を調整し、取得をクリックしてタイムラプス実験を開始します。Ypet 3素数UTR翻訳の解析では、卵母細胞、卵母細胞自体、楕円領域をクリックして、卵母細胞を取り巻く小さな領域を矩形領域をクリックして、2つの領域測定を行います。[ログを開く] をクリックし、[ログ データ] をクリックして、地域の測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
個々の卵母細胞と測定された時間ポイントごとに、YFPとmCherry波長について、卵母細胞領域測定からバックグラウンド領域測定値を別々に差し引きます。分相Iと成熟卵母細胞におけるmCherryとYFPの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照としてプロフェイズIで逮捕された。I逮捕および成熟卵母細胞のシグナルに対する個々のYFP対mCherry比は、YFP信号をフェーズI逮捕および成熟卵母細胞の最後の10時点の平均mCherry信号で割ることによって、注入された体積について修正された。
レポーターYFPの翻訳速度は、線形回帰を用いたシロスターミド放出の後、プロフェイズIおよび成熟卵母細胞におけるYFP対mCherry比を曲線で測定した。レポーターの蓄積は、ゼロ〜2時間と8〜10時間の間の翻訳速度の有意な差によって示されるように線形パターンに従わない、卵母細胞筋細胞成熟中にインターロイキン7翻訳の活性化を示す。このプロトコルを試す場合は、記録の開始時に露出時間が十分であることを確認してください。
卵母細胞の再開中に翻訳が活性化された場合、信号は時間経過中に飽和する可能性があることを覚えておいてください。MRMAの安定性は、PCRにより、YFP用プライマーを用いて確認することができる。翻訳の変化を確認するには、V5技術に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを使用することができます。
