私たちのプロトコルが示すように、CRISPR CasRx技術は、フルーツハエのユビキタスおよび組織特異的遺伝子転写低減を達成するために使用することができます。私たちの技術は、さらなるカスタマイズと最適化と互換性がある一方で、フルーツハエのCRISPRベースの遺伝子転写低減を使用することに興味がある人のためのスターターパッケージを提供します。2つのコンポーネントCasRxシステムを使用して標的とするユビキタスin vivo RNAターゲティングを設定するには、関心のあるホモ接合gRNAラインから10個の処女成人雌ハエを収集し、バランスのとれたヘテロ接合Ubiq CasRx CurlyOから5人の成人男性ハエを収集する。
親のハエをドライイーストパウダー100マイクログラムを補ったバイアルに入れ、バイアルを摂氏26度で48時間後回しにします。毎日バイアルを観察して、F1世代の陰部から新しい成人の子孫が出現したかどうかを確認し、二酸化炭素を持つ成人の誰かが10秒間麻酔を受けているかどうかを確認します。ハエが不動になると、連続した二酸化炭素タンクに接続されたフライパッドにバイアルを空にし、蛍光ステレオ顕微鏡に接続されたカラーカメラを使用してハエのフェノタイプを採点し、画像化します。
次に、蛍光シグナル発現に応じて、異なる表現型を有する子孫数を数える。メンデリア遺伝学に基づいて、子孫の50%が標的RNAを発現すると予想される。Ubiq CasRxシステムの毒性は、子孫を発現する標的RNAの比率を50%未満に減らすことができる3成分CasRxシステムを使用してユビキタスインビボ外生RNAターゲを設定し、二重ルシファーゼ発現ラインから8〜10人のヴァージン成人雌ハエを収集し、バランスのとれたヘテロジーゴウスUbiq CasRxy CurRxs CurX+TMプラスから4〜5匹の成体雄ハエを収集する。 ●白い目、巻き翼、ds赤い蛍光を同時に示すSTBライン。
乾燥酵母粉末の100マイクログラムを補ったバイアルにペアレンタルステップ1クロスバイを置き、26°Cで48時間この十字架を後ろに置きます。インキュベーションの最後に、各バイアルからすべての親のハエを取り除き、少なくとも14日間バイアルを26°Cインキュベーターに戻します。14日間にわたり、前述のように、ホモ接合ホタルルシファーゼから8〜10人の女性の処女を3回標的とするgRNAラインから収集する。
毎日1つのクロスバイアルのステップを観察して、新しい成人の子孫が子犬から出現したかどうかを確認し、二酸化炭素で麻酔をして、Ubiq CasRxと二重ルシファラーゼレポーターの両方を表現する4〜5匹の雄のハエの収集を可能にします。ハエをgRNAラインを標的とするフルーツフライルシファーゼから10人のヴァージンメスと新しいバイアルに入れ、これらのステップ2の十字架を摂氏26度で48時間置きます。ステップ1クロスバイアルからUbiq CasRxとデュアルルシファーゼレポーターの両方を発現する別の5人の1日齢の男性を収集し、マイナス80°Cの貯蔵のために1.5ミリリットル遠心分離機に移す前に、26°Cで2〜4日間ハエをインキュベートします。
インキュベーションの最後に、ステップ2クロスバイアルのそれぞれからすべてのペアレンタルバイアルを取り外します。そして、少なくとも20日間、バイアルを摂氏26度のインキュベーターに戻します。毎日ステップ2のクロスバイアルを観察して、陰性から新しい成人の子孫が出現したかどうかを確認し、利用可能になると二酸化炭素でハエを麻酔し、実証したように彼らの表現型を採点してイメージングします。
メンデリア遺伝学は、すべてのハエが生存可能である場合、子孫の25%が標的RNAを発現すべきであることを示唆している。ルシファーゼアッセイを行うために、三重トランスヘテロ接飛行と制御ハエを実証したように生成する。男性のハエを出生時に収集し、生後3日まで老化させる。
3日間のハエを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、市販のルシファーゼアッセイキットからルシファーゼリシスバッファー内のバッファーを使用してそれらをlyseします。次に、各サンプルとルミノメーターから5マイクロリットルのライズされた組織を使用して、フルーツハエの両方を測定し、標準的なルシファーゼアッセイプロトコルに従ってルシファーゼ活性を実行します。F1、トランスヘテロ接合CasRxは、トランスヘテロ接合dCasRxハエと比較して有意に低い生存率を有する。
3つの標的遺伝子のUbiq CasRxシステムの毒性を確認すると、U6 gRNA Yヘテロ接合ハエは生存不可能であり、第2のインスター幼虫段階を超えて成長しない。生き残ったUbq CasRxおよびU6 gRNA Wヘテロザイゴウスハエは、明確な完全に浸透した広い目の表現型を示す。また、3つの標的遺伝子に対する標的遺伝子転写物の有意な減少も観察される。
CasRxによって誘導されたオフターゲット活性の証拠は、ハエを発現するCasRxからのサンプルとハエを発現するdCasRxからのサンプルとの間の差発現したトランスクリプトを比較する場合にも観察される。2段階の交差では、3つのトランス遺伝子の組み合わせのみが100%致死性をもたらす。CasRxシステム設計を用いた組織特異的RNAターゲティングが採用される場合、UASTプロモーターを用いて全体的なCasRx発現がUbiqプロモーターと比較して低下すると、毒性レベルが低下する。
正しい性別と正しい型のハエを使用して、遺伝的プロセスを正しく設定することが重要です。
