Como nosso protocolo mostra, as tecnologias CRISPR CasRx podem ser usadas para alcançar reduções onipresentes e específicas de transcrição genética em moscas de frutas. Nossa técnica oferece um pacote inicial para quem estiver interessado em usar a redução de transcrição genética baseada em CRISPR em moscas de frutas, ao mesmo tempo em que é compatível com mais personalização e otimização. Para configurar um RNA in vivo onipresente usando um sistema CasRx de dois componentes, colete 10 moscas fêmeas adultas virgens da linha de interesse gRNA homozigous e cinco moscas machos adultos do equilibrado heterozigoso Ubiq CasRx CurlyO.
Coloque as moscas dos pais em um frasco complementado com 100 microgramas de fermento seco em pó eguarde os frascos por 48 horas a 26 graus Celsius. Observe os frascos todos os dias para ver se alguma nova descendência adulta emergiu do púbico da geração F1 e anestesia qualquer um dos adultos com dióxido de carbono por 10 segundos. Uma vez que as moscas se tornam imóveis esvaziar o frasco em uma plataforma de mosca conectada ao tanque de dióxido de carbono com dióxido de carbono contínuo e usar uma câmera colorida conectada a um microscópio estéreo fluorescente para marcar e imagem os fenótipos das moscas.
Em seguida, conte os números de progênero com diferentes fenótipos, de acordo com a expressão do sinal fluorescente. Com base na genética mendeliana, espera-se que 50% da prole expresse o RNA direcionado. Observe que a toxicidade do sistema Ubiq CasRx pode reduzir a proporção de RNA direcionado expressando progênero para menos de 50% Para configurar um RNA exógeno in vivo onipresente usando um sistema CasRx de três componentes, coletar de oito a dez moscas fêmeas adultas virgens de uma linha expressa de luciferase dupla e quatro a cinco moscas machos adultos do equilibrado heterozigous Ubiq CasRx Curly mais TM6, Linha STB que exibe olhos brancos, asas encaracoladas e fluorescência vermelha ds simultaneamente.
Coloque o passo dos pais um passo em um frasco complementado com 100 microgramas de fermento seco em pó e coloque esta cruz por 48 horas a 26 graus Celsius. No final da incubação, remova todas as moscas dos pais de cada frasco e devolva os frascos para a incubadora Celsius de 26 graus por pelo menos 14 dias. Ao longo de 14 dias, como mencionado anteriormente, coletarei oito a dez virgens femininas da luciferase de vagalume homozigous que tem como alvo a linha gRNA três vezes.
Observe o passo um frascos cruzados todos os dias para ver se algum novo gênio adulto emergiu da pupa, anestesiando com dióxido de carbono para permitir a coleta de quatro a cinco moscas machos expressando tanto o Ubiq CasRx quanto o repórter dual Luciferase como disponível. Coloque as moscas em um novo frasco com 10 fêmeas virgens da luciferase de mosca de frutas visando a linha gRNA, e coloque estas cruzes passo dois a 26 graus Celsius por 48 horas. Colete outros cinco machos de um dia de idade expressando tanto o Ubiq CasRx quanto o repórter de luciferase dupla do passo um frascos cruzados e incubar as moscas por dois a quatro dias sozinhos a 26 graus Celsius antes de transferi-los para uma centrífuga de 1,5 mililitro para menos 80 graus Celsius de armazenamento.
No final da incubação, remova todos os frascos parentais de cada um dos frascos cruzados da etapa dois. E devolva os frascos para a incubadora 26 graus Celsius por pelo menos 20 dias. Observe o passo dois frascos cruzados todos os dias para ver se alguma nova descendência adulta emergiu do púbico, anestesiando as moscas com dióxido de carbono à medida que se tornam disponíveis, e marcando e visualizando seus fenótipos como demonstrado.
A genética mendeliana sugere que, se todas as moscas forem viáveis, 25% da prole deve expressar o RNA alvo. Para realizar um ensaio de luciferase, gere as moscas tríplices trans heterozigous, bem como as moscas de controle como demonstrado. Recolher as moscas machos ao nascer, e envelheci-las até três dias de idade.
Transfira as moscas de três dias de idade em tubos de centrífugas de 1,5 mililitro, e lise-os usando um tampão no tampão de luciferase de um kit de ensaio de luciferase disponível comercialmente. Em seguida, use cinco microliters de tecido liose de cada amostra e luminômetro para medir tanto as moscas das frutas quanto a atividade da Luciferase, de acordo com os protocolos padrão de ensaio de luciferase. F1, CasRx heterozigos trans, têm taxas de sobrevivência significativamente menores em comparação com moscas dCasRx heterozigosas trans.
Confirmando a toxicidade do sistema Ubiq CasRx dos três genes alvo, as moscas heterozigous U6 gRNA Y são inviáveis e não crescem além do segundo estágio larval instar. As moscas heterozigous Ubq CasRx e U6 gRNA W, demonstram um fenótipo de olhos arregalados totalmente penetrante. Além disso, também é observada uma redução significativa das transcrições genéticas-alvo para três genes-alvo.
Evidências de atividade fora do alvo induzida pelo CasRx também são observadas quando transcrições diferenciadas expressas entre amostras de CasRx expressando moscas e amostras de moscas expressas dCasRx são comparadas. Na cruz de dois passos, apenas a combinação de todos os três genes trans resulta em uma letalidade de 100%. Quando o direcionamento específico de RNA de tecido usando um design de sistema CasRx de três componentes é empregado, o nível de toxicidade é reduzido quando a expressão geral casRx é reduzida usando o promotor UAST em comparação com o do promotor Ubiq.
É importante configurar o processo genético corretamente usando moscas de gênero correto e fenótipos corretos.
