우리의 프로토콜에서 볼 수 있듯이, CRISPR CasRx 기술은 과일 파리에서 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적 증명서 감소를 달성하기 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 기술은 추가 사용자 정의 및 최적화와 호환되는 동안 과일 파리의 CRISPR 기반 유전자 성적 증명서 감소를 사용하는 데 관심이있는 사람을위한 스타터 패키지를 제공합니다. 두 가지 성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 RNA 타겟팅에서 유비쿼터스를 설정하려면, 균형 잡힌 이종구우스 UbRx CurlyO에서 호모지구스 gRNA 라인에서 10 명의 처녀 성인 여성 파리와 5 명의 성인 남성 파리를 수집합니다.
부모의 파리를 100마이크로그램의 드라이 효모 파우더로 보충한 바이알에 넣고 26°C에서 48시간 동안 바이알을 후면합니다. F1 세대의 음모에서 새로운 성인 자손이 등장하고 10 초 동안 이산화탄소를 가진 성인 중 하나라도 마취했는지 확인하기 위해 매일 바이알을 관찰하십시오. 파리가 움직이지 않게되면 연속 이산화탄소가 있는 이산화탄소 탱크에 연결된 플라이 패드에 유리병을 비우고 형광 스테레오 현미경에 연결된 컬러 카메라를 사용하여 파리의 표현형을 점수화하고 이미지화합니다.
그런 다음 형광 신호 발현에 따라 다른 표현형을 가진 자손의 수를 계산합니다. Mendelian 유전학에 근거하여, 자손의 50%는 표적으로 한 RNA를 표현하기 위하여 예상됩니다. Ubiq CasRx 시스템의 독성은 3 성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 외인성 RNA 표적화에 유비쿼터스를 설정하기 위해 자음을 표현하는 표적 RNA의 비율을 50 % 미만으로 줄일 수 있으며, 이중 루시파아를 표현하는 라인에서 8 ~10 명의 성인 여성 파리를 수집하고 균형 잡힌 쿠루시카스에서 4 ~5 명의 성인 남성 파리를 수집합니다. 흰색 눈, 곱슬 날개 및 ds 빨간 형광을 동시에 나타내는 STB 라인.
100 마이크로그램의 드라이 효모 파우더로 보충된 바이알에 부모의 발걸음을 하나씩 놓고 이 십자가를 섭씨 26도에서 48시간 동안 리어로 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 바이알에서 모든 부모 파리를 제거하고 바이알을 섭씨 26도인큐베이터로 14일 이상 반환합니다. 14 일 동안, 앞서 언급 한 바와 같이 gRNA 라인을 세 번 대상으로 호마시구스 반딧불 루시파라제에서 8 ~10 여성 처녀를 수집합니다.
매일 1개의 십자가 바이알을 관찰하여 새로운 성인 자손이 푸파에서 나타났는지 확인하고, 이산화탄소로 마취하여 Ubiq CasRx와 이중 루시파라제 기자를 모두 표현하는 4~5마리의 수컷 파리를 수집할 수 있습니다. gRNA 라인을 대상으로 열매 플라이 루시파라제에서 10 버진 암컷과 새로운 유리병에 파리를 배치하고, 48 시간 동안 26섭씨2의 십자가를 배치합니다. Ubiq CasRx와 이중 루시파라제 기자를 1단계 에서 모두 표현하는 5명의 노인 남성을 모아 26도에서 단독으로 2~4일 동안 파리를 배양한 후 섭씨 80도를 뺀 1.5밀리리터 원심분리기로 옮기십시오.
인큐베이션이 끝나면 각 단계 2 크로스 바이알에서 모든 부모 바이알을 제거합니다. 그리고 바이알을 섭씨 26도인큐베이터로 20일 이상 반납한다. 매일 2개의 십자가 바이알을 관찰하여 새로운 성인 자손이 음모에서 나타났는지 확인하고, 이산화탄소로 파리를 마취하고, 입증된 바와 같이 표현형을 채점하고 이미징합니다.
Mendelian 유전학은 모든 파리가 실행 가능한 경우에, 자손의 25%가 표적으로 한 RNA를 표현해야 한다는 것을 건의합니다. 루시파라제 분석기를 수행하려면, 시연된 바와 같이 삼중 이종화구파리와 컨트롤 플라이를 생성한다. 출생 시 수컷 파리를 모으고 3일까지 노화합니다.
3일 된 파리를 1.5 밀리리터 원심분리관으로 옮기고, 시판되는 루시파라제 분석 키트에서 루시파라제 리시스 버퍼의 버퍼를 사용하여 리세합니다. 그런 다음 표준 루시파라제 분석 프로토콜에 따라 각 샘플 및 광미계에서 5개의 소리터를 사용하여 과일 파리와 실행된 Luciferase 활동을 모두 측정합니다. F1, 트랜스 이터로즈구우스 CasRx, 트랜스 이종화구우스 dCasRx 파리에 비해 상당히 낮은 생존율을 가지고있다.
3개의 표적 유전자의 Ubiq CasRx 시스템의 독성을 확인하는 U6 gRNA Y 이종구는 실행 가능하지 않으며 두 번째 인스타 애벌레 단계를 넘어 성장하지 않습니다. 살아남은 Ubq CasRx 및 U6 gRNA W heterozygous 파리, 뚜렷한 완전히 관통 넓은 눈 표현형을 보여줍니다. 또한, 3개의 표적 유전자를 위한 표적 유전자 전사체의 현저한 감소도 관찰된다.
CasRx에 의해 유도된 오프 표적 활동의 증거는 또한 파리를 표현하는 CasRx에서 샘플 과 시료 사이 차분형 전사체가 dCasRx 표현 파리에서 비교될 때 관찰됩니다. 2단계 십자가에서, 3개의 트랜스 유전자의 조합만이 100%의 치사성 으로 초래된다. 3개의 성분CasRx 시스템 설계를 이용한 조직 특이적 RNA 표적화가 사용되는 경우, Ubiq 프로모터에 비해 UAST 프로모터를 사용하여 전체 CasRx 발현이 낮아질 때 독성 수준이 감소된다.
올바른 성별과 올바른 표현형의 파리를 사용하여 유전 적 과정을 올바르게 설정하는 것이 중요합니다.
