使用CRISPR/ CasRx在 黑腹果蝇 中无处不在和组织特异性RNA靶向

正如我们的实验方案所示，CRISPR CasRx技术可用于实现果蝇中无处不在和组织特异性基因转录本的减少。我们的技术为任何有兴趣在果蝇中使用基于CRISPR的基因转录本减少的人提供了一个入门包，同时与进一步的定制和优化兼容。要使用双组分CasRx系统建立无处不在的体内RNA靶向，从感兴趣的纯合gRNA系中收集10只处女成年雌性苍蝇，从平衡杂合Ubiq CasRx CurlyO中收集5只成年雄蝇。

将亲本苍蝇放入补充有100微克干酵母粉的小瓶中，并在26摄氏度下将小瓶放置48小时。每天观察小瓶，看看是否有任何新的成年后代从F1一代的耻骨中出现，并用二氧化碳麻醉任何成年人10秒钟。一旦苍蝇变得无法移动，将小瓶倒入与连续二氧化碳罐相连的苍蝇垫上，并使用连接到荧光体视显微镜的彩色相机对苍蝇的表型进行评分和成像。

然后根据荧光信号表达计算具有不同表型的后代的数量。根据孟德尔遗传学，预计50%的后代将表达靶向RNA。请注意，Ubiq CasRx系统的毒性可能会将表达后代的靶向RNA的比例降低到50%以下使用三组分CasRx系统建立无处不在的体内外源RNA靶向，从双荧光素酶表达系收集8至10只处女成年雌性苍蝇，并从平衡杂合Ubiq CasRx Curly加TM6收集4至5只成年雄蝇， 同时呈现白色眼睛、卷曲翅膀和 ds 红色荧光的 STB 线。

将亲本步骤一交叉放入补充有100微克干酵母粉的小瓶中，并在26摄氏度下将此十字架放置48小时。在孵育结束时，从每个小瓶中取出所有亲本苍蝇，并将小瓶返回26摄氏度的培养箱至少14天。如前所述，在14天的过程中，从纯合萤火虫荧光素酶中收集8至10个女性处女，靶向gRNA谱系三次。

每天观察步骤一交叉小瓶，看看是否有任何新的成年后代从蛹中出现，用二氧化碳麻醉，以收集四到五只雄性苍蝇，表达Ubiq CasRx和双路西法酶报告器。将苍蝇放入一个新的小瓶中，其中有10个来自果蝇荧光素酶的新小瓶，靶向gRNA线，并将这些步骤两个交叉放在26摄氏度下48小时。从步骤一交叉小瓶中收集另外五只表达Ubiq CasRx和双荧光素酶报告的一天大雄性，并在26摄氏度下单独孵育苍蝇两到四天，然后将它们转移到1.5毫升的离心机中储存零下80摄氏度。

在孵育结束时，从每个步骤2交叉小瓶中取出所有亲本小瓶。并将小瓶放回26摄氏度的培养箱中至少20天。每天观察步骤二交叉小瓶，看看是否有任何新的成年后代从耻骨中出现，在苍蝇可用时用二氧化碳麻醉苍蝇，并对其表型进行评分和成像，如图所示。

孟德尔遗传学表明，如果所有的苍蝇都是活的，那么25%的后代应该表达靶向RNA。要进行荧光素酶测定，生成三反式杂合蝇以及所示的对照蝇。在出生时收集雄性苍蝇，并将它们老化到三天大。

将三天大的苍蝇转移到1.5毫升的离心管中，并使用市售荧光素酶测定试剂盒中的荧光素酶裂解缓冲液中的缓冲液裂解它们。然后使用来自每个样品和光度的五微升裂解组织，根据标准的荧光素酶测定方案测量果蝇和运行的荧光素酶活性。F1，反式杂合CasRx，与反式杂合dCasRx苍蝇相比，存活率显着降低。

证实了三个靶基因的Ubiq CasRx系统的毒性，U6 gRNA Y杂合蝇是不可存活的，并且不会超过第二龄幼虫阶段。幸存的Ubq CasRx和U6 gRNA W杂合子蝇表现出明显的完全渗透性大眼表型。此外，还观察到三个靶基因的靶基因转录本显着减少。

当比较来自表达CasRx的苍蝇的样品和来自dCasRx表达苍蝇的样品之间的差异表达转录本时，还可以观察到CasRx诱导的脱靶活性的证据。在两步交叉中，只有所有三个反式基因的组合才能产生100%的致死率。当采用三组分CasRx系统设计靶向组织特异性RNA时，当使用UAST启动子降低整体CasRx表达时，与Ubiq启动子相比，毒性水平降低。

使用正确性别和正确表型的苍蝇正确设置遗传过程非常重要。