Come mostra il nostro protocollo, le tecnologie CRISPR CasRx possono essere utilizzate per ottenere riduzioni del trascritto genico ubiquitario e specifico del tessuto nei moscerini della frutta. La nostra tecnica offre un pacchetto iniziale per chiunque sia interessato a utilizzare la riduzione del trascritto genetico basata su CRISPR nei moscerini della frutta, pur essendo compatibile con ulteriori personalizzazioni e ottimizzazioni. Per impostare un targeting RNA in vivo onnipresente utilizzando un sistema CasRx a due componenti, raccogliere 10 mosche femmine adulte vergini dalla linea di interesse omozigote gRNA e cinque mosche maschi adulte dall'eterozigote bilanciato Ubiq CasRx CurlyO.
Posizionare le mosche parentali in una fiala integrata con 100 microgrammi di lievito secco in polvere e allevare le fiale per 48 ore a 26 gradi Celsius. Osserva le fiale ogni giorno per vedere se qualche nuova progenie adulta è emersa dal pubico della generazione F1 e anestetizzare uno qualsiasi degli adulti con anidride carbonica per 10 secondi. Una volta che le mosche diventano immobili svuota la fiala su un fly pad collegato al serbatoio di anidride carbonica con anidride carbonica continua e usa una telecamera a colori collegata a uno stereomicroscopio fluorescente per segnare e visualizzare i fenotipi delle mosche.
Quindi contare i numeri di progenie con fenotipi diversi, in base all'espressione del segnale fluorescente. Sulla base della genetica mendeliana, ci si aspetta che il 50% della progenie esprima l'RNA mirato. Si noti che la tossicità del sistema Ubiq CasRx può ridurre il rapporto tra l'RNA mirato che esprime progenie a meno del 50% Per impostare un targeting RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti, raccogliere da otto a 10 mosche femmine adulte vergini da una doppia linea di espressione luciferasi e da quattro a cinque mosche maschi adulti dal bilanciato eterozigote Ubiq CasRx Curly più TM6, Linea STB che mostra contemporaneamente occhi bianchi, ali ricci e fluorescenza rossa ds.
Posizionare il passaggio parentale un cross-by in una fiala integrata con 100 microgrammi di polvere di lievito secco e sollevare questa croce per 48 ore a 26 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere tutte le mosche parentali da ciascuna fiala e riportare le fiale all'incubatrice a 26 gradi Celsius per almeno 14 giorni. Nel corso di 14 giorni, come accennato in precedenza, raccogliere da otto a 10 vergini femmine dalla lucciola omozigote luciferasi che prende di mira la linea gRNA tre volte.
Osserva le fiale incrociate ogni giorno per vedere se dalle pupe sono emerse nuove progenie adulte, anestetizzando con anidride carbonica per consentire la raccolta di quattro o cinque mosche maschio che esprimono sia l'Ubiq CasRx che il doppio reporter Luciferasi come disponibile. Metti le mosche in una nuova fiala con 10 femmine vergini dalla luciferasi del moscerino della frutta che prende di mira la linea del gRNA e posiziona queste croci di fase due a 26 gradi Celsius per 48 ore. Raccogli altri cinque maschi di un giorno che esprimono sia l'Ubiq CasRx che la doppia luciferasi reporter dalle fiale incrociate del passo uno e incuba le mosche per due o quattro giorni da solo a 26 gradi Celsius prima di trasferirle in una centrifuga da 1,5 millilitri per meno 80 gradi Celsius di conservazione.
Al termine dell'incubazione, rimuovere tutte le fiale parentali da ciascuna delle due fiale incrociate. E riportare le fiale all'incubatrice a 26 gradi Celsius per almeno 20 giorni. Osserva le fiale incrociate del passaggio due ogni giorno per vedere se qualche nuova progenie adulta è emersa dal pubico, anestetizzando le mosche con anidride carbonica man mano che diventano disponibili e segnando e visualizzando i loro fenotipi come dimostrato.
La genetica mendeliana suggerisce che, se tutte le mosche sono vitali, il 25% della progenie dovrebbe esprimere l'RNA mirato. Per eseguire un test di luciferasi, generare le mosche triplo trans eterozigoti e le mosche di controllo come dimostrato. Raccogliere le mosche maschili alla nascita e invecchiarle fino a tre giorni.
Trasferire le mosche di tre giorni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri e lisarle utilizzando un tampone nel tampone di lisi della luciferasi da un kit di analisi della luciferasi disponibile in commercio. Quindi utilizzare cinque microlitri di tessuto lisato da ciascun campione e luminometro per misurare sia i moscerini della frutta che l'attività della luciferasi eseguita, secondo i protocolli standard di dosaggio della luciferasi. F1, CasRx trans eterozigote, hanno tassi di sopravvivenza significativamente più bassi rispetto alle mosche dCasRx trans eterozigoti.
Confermando la tossicità del sistema Ubiq CasRx dei tre geni bersaglio, le mosche eterozigoti U6 gRNA Y non sono vitali e non crescono oltre il secondo stadio larvale instar. Le mosche eterozigoti Ubq CasRx e U6 gRNA W sopravvissute, dimostrano un fenotipo distinto completamente penetrante dagli occhi larghi. Inoltre, si osserva anche una significativa riduzione dei trascritti del gene bersaglio per tre geni bersaglio.
L'evidenza di attività fuori bersaglio indotta da CasRx si osserva anche quando vengono confrontati i trascritti differenziali espressi tra i campioni di mosche che esprimono CasRx e campioni di mosche che esprimono dCasRx. Nella croce a due fasi, solo la combinazione di tutti e tre i geni trans si traduce in una letalità al 100%. Quando viene utilizzato il targeting dell'RNA specifico del tessuto utilizzando un design del sistema CasRx a tre componenti, il livello di tossicità viene ridotto quando l'espressione complessiva di CasRx viene abbassata utilizzando il promotore UAST rispetto a quello del promotore Ubiq.
È importante impostare correttamente il processo genetico utilizzando mosche di sesso corretto e fenotipi corretti.
