Как показывает наш протокол, технологии CRISPR CasRx могут быть использованы для достижения повсеместного и тканеспецифического снижения транскрипта генов у плодовых мушек. Наша методика предлагает стартовый пакет для всех, кто заинтересован в использовании редукции транскрипта генов у плодовых мушек на основе CRISPR, будучи совместимым с дальнейшей настройкой и оптимизацией. Чтобы создать вездесущую РНК-таргетинг in vivo с использованием двухкомпонентной системы CasRx, соберите 10 девственных взрослых самок мух из гомозиготной линии гРНК и пять взрослых самцов мух из сбалансированного гетерозиготного Ubiq CasRx CurlyO.
Поместите родительских мух в флакон, дополненный 100 микрограммами сухого дрожжевого порошка, и задней части флаконов в течение 48 часов при температуре 26 градусов цельсия. Наблюдайте за флаконами каждый день, чтобы увидеть, появилось ли какое-либо новое взрослое потомство из лобка поколения F1, и обезболивайте кого-либо из взрослых углекислым газом в течение 10 секунд. Как только мухи становятся неподвижными, опустошите флакон на подушке, соединенной с резервуаром с углекислым газом с непрерывным углекислым газом, и используйте цветную камеру, подключенную к флуоресцентному стереомикроскопу, чтобы оценить и визуализировать фенотипы мух.
Затем подсчитайте количество потомства с различными фенотипами, в соответствии с экспрессией флуоресцентного сигнала. Основываясь на менделевской генетике, ожидается, что 50% потомства экспрессируют целевую РНК. Обратите внимание, что токсичность системы Ubiq CasRx может снизить отношение целевой РНК, экспрессирующей потомство, до менее чем 50% Чтобы создать вездесущую экзогенную РНК-нацеленность in vivo с использованием трехкомпонентной системы CasRx, соберите от восьми до 10 взрослых самок Virgin с двойной экспрессирующей линии люциферазы и от четырех до пяти взрослых самцов мух из сбалансированного гетерозиготного Ubiq CasRx Curly plus TM6, Линия STB, которая демонстрирует белые глаза, кудрявые крылья и красную флуоресценцию одновременно.
Поместите родительский шаг один крест в флакон, дополненный 100 микрограммами сухого дрожжевого порошка, и задней части этого креста в течение 48 часов при 26 градусах Цельсия. В конце инкубации удалите всех родительских мух из каждого флакона и верните флаконы в инкубатор с температурой 26 градусов Цельсия в течение не менее 14 дней. В течение 14 дней, как упоминалось ранее, соберите от восьми до 10 женщин-девственниц из гомозиготной люциферазы светлячка, нацеленной на линию гРНК три раза.
Наблюдайте за первым шагом перекрестных флаконов каждый день, чтобы увидеть, появились ли какие-либо новые взрослые потомки из куколок, обезболивая углекислым газом, чтобы позволить собрать от четырех до пяти самцов мух, экспрессирующих как Ubiq CasRx, так и двойной репортер Люциферазы, как доступно. Поместите мух в новый флакон с 10 девственными самками из люциферазы плодовой мухи, нацеленной на линию гРНК, и поместите эти промежуточные два креста при 26 градусах Цельсия в течение 48 часов. Соберите еще пять однодневных самцов, выражающих как Ubiq CasRx, так и двойной репортер люциферазы из флаконов первого шага и высиживайте мух в течение двух-четырех дней в одиночку при 26 градусах Цельсия, прежде чем перенести их в центрифугу с диагональю 1,5 миллилитра для хранения минус 80 градусов по Цельсию.
В конце инкубации извлеките все родительские флаконы из каждого из двух поперечных флаконов. И вернуть флаконы в инкубатор при температуре 26 градусов Цельсия не менее чем на 20 дней. Наблюдайте за вторым шагом перекрестных флаконов каждый день, чтобы увидеть, появилось ли какое-либо новое взрослое потомство из лобка, обезболивая мух углекислым газом по мере их появления, а также оценивая и визуализируя их фенотипы, как показано.
Менделевская генетика предполагает, что, если все мухи жизнеспособны, 25% потомства должны экспрессировать целевую РНК. Чтобы выполнить анализ люциферазы, сгенерируйте тройные транс-гетерозиготные мухи, а также контрольные мухи, как показано. Собирая самцов мух при рождении, и старейте их до трехдневного возраста.
Переведите трехдневных мух в 1,5-миллилитровые центрифужные трубки и лизируйте их, используя буфер в буфере лизиса люциферазы из коммерчески доступного набора для анализа люциферазы. Затем используйте пять микролитров лизированной ткани из каждого образца и люминометра, чтобы измерить как плодовых мушек, так и активность люциферазы, в соответствии со стандартными протоколами анализа люциферазы. F1, транс-гетерозиготные CasRx, имеют значительно более низкие показатели выживаемости по сравнению с транс-гетерозиготными мухами dCasRx.
Подтверждая токсичность системы Ubiq CasRx трех генов-мишеней, гетерозиготные мухи U6 gRNA Y нежизнеспособны и не растут за пределами второй личиночной стадии. Выжившие гетерозиготные мухи Ubq CasRx и U6 gRNA W демонстрируют отчетливый полностью проникающий широкоглазый фенотип. Кроме того, также наблюдается значительное снижение транскриптов генов-мишеней для трех генов-мишеней.
Доказательства нецелевой активности, индуцированной CasRx, также наблюдаются при сравнении дифференциальных экспрессированных транскриптов между образцами из CasRx, экспрессирующими мухи, и образцами из dCasRx,экспрессирующих мух. В двухступенчатом кроссе только комбинация всех трех транс-генов приводит к 100% летальности. Когда используется тканеспецифическое нацеливание РНК с использованием трехкомпонентной конструкции системы CasRx, уровень токсичности снижается, когда общая экспрессия CasRx снижается с помощью промотора UAST по сравнению с промотором Ubiq.
Важно правильно настроить генетический процесс, используя мух правильного пола и правильных фенотипов.
