このプロトコルは、筋線維機能に対する遺伝子変異の影響を評価するために使用できます。さらに、筋肉の健康を改善することを目的とした薬物スクリーニング研究にも使用できます。この技術は、高度なトレーニングを必要とせずに、比較的短時間で多数の筋線維の収縮性を分離および測定するために使用できます。
ヒドロゲルの組成は、健康な筋肉と病気の筋肉の両方における環境手がかりの効果を証明するために変更することができます。手順の最も困難な部分は、筋肉の最初の解剖です。十分な注意が払われていない場合、筋肉の損傷は筋線維の生存率の低下につながる可能性があります。
手順を実演するのは、研究技術者のリアンダー・フォンクと、私の研究室の博士課程の候補者であるオスマン・エセンです。安楽死させたマウスの下後肢を足首のすぐ上で切ることから始めます。足の背側の皮膚をつま先に向かって切開します。
筋肉を傷つけないように注意しながら、つま先に向かって皮膚を慎重にはがします。解剖した足を、摂氏37度で事前に温めた解剖培地10ミリリットルを含むシールガード皿に入れます。つま先に付着したままの皮膚を通して足を固定します。
足首を越えて下肢を固定し、筋肉の上にある結合組織を慎重に切除します。かかとで腱を切り、筋肉を持ち上げます。つま先の腱が露出するまで、結合組織を通して筋肉の横と下を切ります。
3つの腱の長さの半分が露出したら腱を切る。足から筋肉を解放し、FDB筋肉の腱を固定します。筋肉から残っている結合組織を取り除きます。
きれいな筋肉組織を、予め温めた解剖培地を含むチューブに移します。血清学的ピペットを使用して、筋消化培地を含むチューブにブレビス筋を移します。組織を摂氏37度のインキュベーターに5%二酸化炭素で80分間置きます。
3ミリリットルの解剖媒体を含む15ミリリットルのチューブに筋肉を移します。準備された摩砕チップを使用して、筋肉を最大から最小へとピペットで移動させ、筋繊維が腱から外れるまで猛合を続けます。腱はP200チップで取り外すことができます。
解離した筋線維を、10ミリリットルの解剖媒体を含む15ミリリットルのチューブに移します。ペレットが形成されるまで、繊維をインキュベーター内で20分間沈降させます。繊維ペレットの上からすべての培地を注意深くピペットで取ります。
氷上で、筋肉あたり875マイクロリットルの細胞ミックスに細胞を再懸濁します。125マイクロリットルのマトリックスセルミックスを、125マイクロリットルの細胞懸濁アリコートを含むチューブに加えます。泡の形成を避けながら、穏やかなピペッティングで混合します。
最終ミックスをすぐにウェルに移します。顕微鏡で筋線維の生存率を確認してください。ゲルをインキュベーターに30〜45分間入れて、固化を促進します。
完了したら、500マイクロリットルの培地を各ウェルに慎重に加えます。光学ベースの収縮測定システム、蛍光灯、電気セルペーサー、およびコンピューターの電源を入れます。電気刺激装置を10ボルトで1.0ヘルツに設定し、パルス持続時間は5ミリ秒で、孤立した筋線維を刺激します。
プレートを測定システムに挿入します。ペーサーをインサートに接続し、培養プレートに挿入します。プログラムを開きます イオンウィザード.
OK をクリックします。[ファイル] アイコンをクリックして新しいファイルを開き、[新規] をクリックします。[実験の収集]を選択して、プログラムが正しい実験骨格サルコメアにあるかどうかを確認します。実験を変更するには、目的の実験をクリックし、[追加] を押します。
SARC 20X、平均ライン、シングルFFT、250ヘルツのサンプリングレート、および10秒の取得時間の設定を適用します。測定システムの温度を摂氏25度に変更します。開いているセルファインダーをクリックして、新しい画面ポップアップを作成します。
[プレート タイプ] と [アクティブ ウェル] を選択します。フォーカススライダーバーを調整して、ファイバーに焦点を合わせます。ペーシングを有効にして電気刺激を誘発し、ファイバーのけいれんを観察します。
サルコメアに焦点を合わせたまま、サルコメアが垂直に走るように、測定領域がファイバーの端に固定されていることを確認します。サルコメアに焦点が合っていると、ツールバーに単一のピークが表示され、収縮すると右に移動します。測定システムで繊維を測定します。
[開始] をクリックして実験を開始します。Qキーを押して、10個の収縮トランジェントの測定を開始します。4つ以上のトランジェントにノイズがないように見える場合は、Zキーを押して測定を受け入れます。
トランジェントに含まれるノイズが多すぎる場合は、測定を除外します。実験が終了したら、[停止]を押してセルファインダーウィンドウを閉じます。ファイルを保存し、新しいファイルを作成します。
プログラムCytoSolverデスクトップを開き、インポートをクリックして分析するファイルを選択します。分析が完了したら、青、赤、灰色のピークを特定します。[エクスポート]をクリックします。
[平均から一時データ] というタイトルのボックスを選択し、Excel にエクスポートします。3Dフィブリンヒドロゲルでは、側方運動やその他の影響因子を防ぐことができるため、使用可能な収縮筋測定値の割合が高くなりました。繊維包埋は,最大収縮速度やサルコメア短縮に有意な影響を及ぼさなかった。
純粋な基底マトリックスにおける収縮の減少は、おそらくゲルの剛性または細胞マトリックス相互作用の増加に起因するものが観察された。同様に、基底マトリックス埋め込みも、フィブリンヒドロゲルと比較してサルコメア短縮を減少させた。孤立した筋繊維は非常に壊れやすいため、ピペッティング中に損傷しないように特別な注意を払う必要があることを覚えておくことが重要です。
単離手順の後、免疫染色、タンパク質およびRNA単離などの方法も実施され得る。この技術の開発は、成熟した筋線維機能をハイスループットで研究する新しい可能性を開きました。
