L’échographie fonctionnelle est une nouvelle modalité de neuroimagerie qui permet de cartographier le volume sanguin cérébral dans le cerveau vivant des rongeurs. En utilisant l’imagerie par ondes planes ultra rapides, nous pouvons mesurer les réponses hémodynamiques du cerveau entier avec une résolution et une sensibilité temporaires spéciales inégalées. Ce protocole explique comment effectuer une échographie fonctionnelle transcrânienne chez la souris, à la fois pour les expériences sur les animaux anesthésisés et éveillés.
Comparée à d’autres techniques d’imagerie fonctionnelle du cerveau entier telles que l’IRMF, l’échographie fonctionnelle offre une portabilité élevée, une facilité d’utilisation et permet des expériences sur des sujets éveillés et en mouvement libre, évitant les biais d’anesthésie et permettant des études comportementales. Jusqu’à récemment, l’imagerie FUS n’était utilisée qu’en collaboration avec un expert en échographie. Maintenant, cette technologie est disponible pour la vaste communauté des neurosciences, grâce à des scanners disponibles dans le commerce et à un logiciel dédié à l’imagerie cérébrale préclinique, ce qui rend FUS assez facile à utiliser sans aucune formation en échographie.
Pour une séance d’imagerie anesthésiée, appliquez une pommade oculaire sur les yeux de la souris pour éviter tout dommage à la cornée et rasez la tête de la souris à l’aide d’un tremblement. Appliquez un peu de crème dépilatoire et rincez après quelques minutes. Répétez cette opération jusqu’à ce que les poils soient complètement enlevés.
Insérez des broches sous-cutanées dans les membres pour l’enregistrement de l’électrocardiogramme et placez un gel à ultrasons centrifuge sur la tête. Pour les expériences sur des souris éveillées, une chirurgie préliminaire est nécessaire pour la fixation de la tête. Placez la souris anesthésisée et un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius.
Appliquez un gel protecteur pour les yeux et administrez de la lidocaïne par voie sous-cutanée sous le cuir chevelu à l’aide d’une aiguille de calibre 26, puis attendez quelques minutes. Faites une incision après la suture sagittale de l’arrière de l’os occipital jusqu’au début de l’os nasal, puis utilisez des ciseaux chirurgicaux pour exciser la peau sur les deux hémisphères. Nettoyez le crâne avec une solution d’iode à un pour cent et retirez tout périoste restant.
En utilisant la plaque de tête comme modèle, marquez deux trous dans le crâne pour positionner les vis d’ancrage. Positionnez la plaque de tête avec les vis et utilisez du ciment dentaire pour fixer les vis et la plaque de tête à l’avant et à l’arrière du cadre pour maintenir une bonne adhérence de l’implant. Retirer l’animal du cadre stéréotaxique une fois le ciment sec et inverser l’anesthésie par injection sous-cutanée d’un milligramme par kilogramme d’atipamezole.
Administrer du méloxicam prophylactique pour la douleur postopératoire. Placez un capuchon magnétique imprimé en 3D sur la plaque de tête pour la protéger et laissez la souris récupérer pendant quatre à six jours avant le début de l’accoutumée à la cage de la maison mobile. Placez l’animal dans une cage de récupération sur un coussin chauffant pendant quelques heures, puis ramenez la souris dans sa cage d’origine avec des compagnons de litière.
Les quatrième et cinquième jours après la récupération, serrez à plusieurs reprises la souris dans la cage de la maison mobile et augmentez progressivement le temps fixe de la tête, à partir de cinq minutes et jusqu’à 30 minutes. Appliquez un peu de solution saline et de gel à ultrasons sur la fenêtre d’imagerie pour habituer la souris. Répétez ce processus le sixième jour après la récupération.
Démarrez le logiciel et créez une session d’expérimentation. Accédez au menu Déplacer la sonde pour régler la position de la sonde à ultrasons à l’aide du clavier de navigation. Démarrez l’acquisition de la vue en direct et ajustez la position de la sonde si nécessaire via l’imagerie en temps réel du volume sanguin cérébral de l’animal, ou CBV.
Alignez le cerveau au centre de l’image, puis optimisez les paramètres d’imagerie pour capturer le rapport signal/bruit le plus élevé. Ouvrez l’option Angio 3D du logiciel d’acquisition. Sur le panneau prédéfini, ajustez les paramètres de balayage de la première tranche, de la dernière tranche et de la taille de l’étape afin de scanner tout le cerveau et de commencer l’acquisition.
Laissez le logiciel d’acquisition ouvert et démarrez le logiciel pour l’analyse et la visualisation des données, puis chargez le scan 3D Angio. Parcourez le volume d’acquisition à l’aide du panneau des trois vues et sélectionnez la direction du balayage coronal, l’antéropostérieur ou l’antérânienne posturale. Accédez au panneau d’enregistrement du cerveau et chargez le modèle de référence de la souris pour le processus d’enregistrement.
Enregistrez l’analyse sur le cadre de coordonnées communes Allen Mouse à l’aide des modes d’enregistrement entièrement automatique ou manuel. Vérifiez le résultat en regardant la superposition du scan 3D Angio et du modèle de référence, ou en regardant la superposition du scan et de l’Atlas de référence Allen à l’aide du panneau Gestionnaire Atlas. Enregistrez l’enregistrement en tant que fichier BPS.
Dans le logiciel ICO studio, assurez-vous que l’analyse angiographique et son fichier BPS sont chargés. Accédez au panneau de navigation du cerveau. Dans le panneau Atlas Manager, naviguez dans la souris Allen Brain Atlas avec le navigateur de l’arborescence enfant parent.
Trouvez les régions anatomiques ciblées et sélectionnez-les pour les superposer au scan dans les trois vues. Visualisez les régions ciblées dans le panneau des trois vues et choisissez un plan d’imagerie qui chevauche les régions ciblées pour l’expérience en définissant manuellement deux marqueurs sur la position coronale qui inclut la région d’intérêt. Cliquez sur Brain Positioning System, ou BPS, pour extraire les coordonnées motrices résultantes qui correspondent à la position de la sonde pour imager le plan ciblé.
Vérifiez l’aperçu de l’image qui est calculé à partir de l’angio scan. Dans le logiciel de numérisation ICO, entrez dans le panneau de positionnement de la sonde et cliquez sur Entrer les coordonnées BPS, puis appliquez les coordonnées extraites, ce qui provoque le déplacement et l’alignement de la sonde sur le plan d’imagerie ciblé. Effectuez une acquisition en vue réelle et vérifiez que le plan d’imagerie actuel correspond à la prédiction.
Prédéfinissez la séquence de stimulation, y compris le temps de stimulation, le temps de stimulation de l’intérêt et le nombre de répétitions. Exécutez une séquence FUS 3D en définissant le temps total d’acquisition, le nombre de positions et le temps mort entre les positions. Pour une stimulation automatique synchronisée avec le système d’acquisition via l’entrée TTL, sélectionnez l’option trig in avant de commencer l’acquisition.
Ouvrez l’acquisition dans le logiciel ICO Studio et entrez dans le menu de la carte d’activation, puis remplissez le champ du modèle d’activation avec des heures de début et de fin et calculez la carte d’activation. Ajustez les paramètres d’affichage pour la visualisation et exportez la carte d’activation sous forme de fichier H5 pour une analyse hors ligne. Exécutez une séquence FUS 3D en définissant le temps total d’acquisition, le nombre de positions du plan d’imagerie et le temps mort entre les positions.
Enregistrez l’acquisition et chargez-la dans le logiciel ICO Studio. Si nécessaire, chargez le fichier BPS et le cadre de coordination cérébrale Allen Mouse. Dans atlas manager, sélectionnez les régions de l’Atlas comme régions d’intérêt.
Entrez dans le menu de conductivité fonctionnelle et sélectionnez les régions souhaitées et le gestionnaire de retour sur investissement. Visualisez les résultats sous forme de matrice de connectivité ou de carte de corrélation basée sur les amorçages, puis sélectionnez et ajustez les filtres de bande passante comme vous le souhaitez et exportez les résultats de corrélation pour une analyse statistique. Ce protocole a été utilisé pour la quantification 3D des variations hémodynamiques cérébrales transcrâniennes dans le cerveau de la souris.
La stimulation des moustaches a été choisie comme exemple de stimulation sensorielle de réponse évoquée. L’activation significative a été déterminée avec une résolution d’un modèle linéaire général, ou GLM, en utilisant la fonction de réponse hémodynamique de la souris par défaut. Le temps d’essai total était de 760 secondes, avec une ligne de base de 60 secondes, une stimulation de 80 secondes et un temps de récupération de 60 secondes répété cinq fois.
En utilisant un cours temporel voxel du cortex somatosensoriel primaire controlatéral, la région du champ de baril, ou S1BF, a révélé une augmentation de 15 à 20% du CBV par rapport à l’inclusion. Le même paradigme a été appliqué dans une souris à tête fixe se comportant dans la cage de la maison mobile en utilisant le préréglage éveillé du scan ICO. La carte d’activation après une expérience de stimulation à plusieurs moustaches est montrée ici.
Une activation significative a été déterminée avec la résolution d’un GLM à l’aide d’une fonction de réponse hémodynamique de souris par défaut. Les corrélations temporelles ont normalisé les fluctuations spontanées du CBV à basse fréquence entre les régions cérébrales 3D chez une souris anesthésisée à la kétamine xylazine sont montrées ici. L’analyse basée sur les graines et l’hippocampe dorsal ont révélé la conductivité interhémisphérique significative entre l’hippocampe droit et gauche, ainsi que des régions rétro-hippocampiques plus profondes et des courtoisies piriformes.
Une région de semence sélectionnée dans le S1BF a également donné lieu à un modèle de corrélation symétrique. Le point critique pour des expériences réussies est la préparation des animaux, en particulier le niveau d’anesthésie pour les expériences impliquant des animaux anesthésiés et la protection d’un crâne dans les expériences sur des animaux éveillés. Si les États-Unis nous ont permis d’étudier des fonctions cérébrales importantes chez des animaux éveillés traitant de questions fondamentales sur le sommeil, l’apprentissage ou le comportement, mais aussi la modulation pharmacologique de la connectivité fonctionnelle pour la découverte de médicaments.
