功能性超声是一种新的神经影像学检查方式，可以绘制活啮齿动物大脑中脑血容量的图谱。使用超快速平面波成像，我们可以测量具有无与伦比的特殊临时分辨率和灵敏度的全脑血流动力学反应。该协议解释了如何在小鼠中进行经颅功能超声成像，用于麻醉和清醒动物实验。
与FMRI等其他全脑功能成像技术相比，功能超声提供了高便携性，易用性，并允许在清醒和自由移动的受试者中进行实验，避免麻醉偏差并实现行为研究。直到最近，FUS成像才与超声专家合作使用。现在，这项技术可供广泛的神经科学界使用，这要归功于市售的扫描仪和用于临床前脑成像的专用软件，这使得FUS非常易于使用，没有任何超声波背景。
对于麻醉成像过程，将眼药膏涂抹在小鼠眼睛上以避免任何角膜损伤，并使用震颤剃掉小鼠头部。涂抹一些脱毛霜，几分钟后冲洗干净。重复此步骤，直到头发完全脱落。
在四肢中插入皮下插针以进行心电图记录，并将离心超声凝胶放在头部。对于清醒的小鼠实验，需要进行头部固定的初步手术。将麻醉的鼠标和立体定向框架放在37摄氏度的加热垫上。
将保护凝胶涂抹在眼睛上，并使用26号针头皮下皮下注射利多卡因，然后等待几分钟。沿着矢状缝线从枕骨后面到鼻骨的起点做一个切口，然后用手术剪刀切除两个半球的皮肤。用百分之一的碘溶液清洁颅骨，并去除任何剩余的骨膜。
使用头板作为模板，在颅骨上标记两个孔以定位锚固螺钉。用螺钉定位头板，并使用牙科水泥将螺钉和头板固定在框架的正面和背面，以保持植入物的良好抓地力。在水泥干燥后，将动物从立体定向框架中取出，并通过皮下注射每公斤阿替帕咪唑一毫克来逆转麻醉。
预防性使用美洛昔康治疗术后疼痛。在头板上放置一个磁性3D打印的盖子以进行保护，并允许鼠标在开始适应移动房屋笼子之前恢复四到六天。将动物放在加热垫上的恢复笼中几个小时，然后将小鼠与猫砂伴侣一起放回其家庭笼中。
在恢复后的第四天和第五天，反复将鼠标夹在移动房屋笼子上，并逐渐增加头部固定时间，从5分钟开始，一直到30分钟。在成像窗口上涂抹一些生理盐水和超声凝胶，使小鼠习惯。在恢复后的第六天重复此过程。
启动软件并创建实验会话。转到移动探头菜单，使用导航键盘调整超声探头的位置。开始实时取景，并在需要时通过动物脑血容量或CBV的实时成像来调整探针位置。
将大脑对准图像的中心，然后优化成像参数以捕获最高的信噪比。打开采集软件的 Angio 3D 选项。在预设面板上，调整第一个切片、最后一个切片和步长扫描参数，以便扫描整个大脑并开始采集。
将采集软件保持打开状态并启动软件进行数据分析和可视化，然后加载 Angio 3D 扫描。使用三视图面板浏览采集体积，并选择冠状扫描方向、前后位或姿势前。转到大脑注册面板并加载用于注册过程的鼠标参考模板。
使用全自动或手动套准模式在 Allen 鼠标通用坐标框架上注册扫描。通过查看 Angio 3D 扫描和参考模板的叠加，或使用 Atlas 管理器面板查看扫描和 Allen 参考图集的叠加来检查结果。将注册另存为 BPS 文件。
在ICO工作室软件中，确保加载了血管造影扫描及其BPS文件。转到大脑导航面板。在"Atlas 管理器"面板中，使用父子树导航器浏览鼠标 Allen Brain Atlas。
查找解剖学目标区域并选择它们以将它们叠加到三个视图中的扫描中。在三视图面板中可视化目标区域，并通过在包含感兴趣区域的日冕位置上手动设置两个标记，选择与实验目标区域重叠的成像平面。单击"大脑定位系统"（BPS）以提取与探头位置相对应的所得运动坐标，以对目标平面进行成像。
检查从血管造影扫描中计算出的图像的预览。在ICO扫描软件中，进入探头定位面板并单击输入BPS坐标，然后应用提取的坐标，使探头在目标成像平面上移动和对齐。执行实时取景并检查当前成像平面是否与预测值相对应。
预先确定刺激顺序，包括刺激时间、兴趣刺激时间和重复次数。通过定义采集的总时间、位置数和位置之间的死区时间来运行 3D FUS 序列。要通过TTL输入与采集系统同步的自动刺激，请在开始采集之前选择三角选项。
在ICO工作室软件中打开采集并进入激活图菜单，然后用开始和结束时间填充激活模式字段并计算激活图。调整显示参数以进行可视化，并将激活图导出为 H5 文件以进行离线分析。通过定义采集的总时间、成像平面位置的数量和位置之间的死区时间来运行 3D FUS 序列。
保存采集并将其加载到ICO工作室软件中。如有必要，加载 BPS 文件和 Allen Mouse Brain Coordination Framework。在地图集管理器中，选择地图集的区域作为感兴趣区域。
进入功能电导率菜单，然后选择所需的区域和ROI管理器。将结果可视化为连通性矩阵或基于种子的相关图，然后根据需要选择和调整带宽过滤器，并导出相关结果以进行统计分析。该协议用于小鼠大脑中经颅脑脑血流动力学变异的3D定量。
选择晶须刺激作为感觉刺激诱发反应的一个例子。使用默认小鼠血流动力学反应函数，使用一般线性模型或GLM的分辨率确定显着激活。总试验时间为760秒，基线为60秒，刺激时间为80秒，恢复时间为60秒，重复5次。
使用对侧初级躯体感觉皮层的体素明智时间过程，桶场区域或S1BF显示与基线相比，CBV增加了15%至20%。使用ICO扫描的唤醒预设，在移动房屋笼中的头部固定行为鼠标中应用了相同的范例。图中显示了多晶须刺激实验后的激活图。
使用默认的小鼠血流动力学反应函数确定GLM分辨率显着激活。这里显示了氯胺酮甲苯噻嗪麻醉小鼠中3D脑区域之间的低频自发CBV波动的时间相关性。基于种子的分析和背海马体揭示了左右海马体之间显着的半球间电导率，以及更深的逆向海马区域和梨状礼貌。
在 S1BF 中选择的种子区域也产生了对称的相关模式。成功实验的关键点是动物准备，特别是涉及麻醉动物的实验的麻醉水平和清醒动物实验中头骨的保护。如果US使我们能够研究清醒动物的重要大脑功能，处理有关睡眠，学习或行为的基本问题，以及药物发现的功能连接的药理学调节。
